Ziele
- Machen Sie sich mit der Speziation der Gattung Staphylokokken vertraut.
- Wachsen und identifizieren Sie verschiedene Staphylokokkenarten mit selektivem und differentiellem Agar
- Identifizieren Sie die 3 hämolytischen Typen auf Blut-Agar.,
Staphylococcus ist eine Gattung von Gram +, nonspore-bildenden Kokken der Familie Micrococcaceae, die oft als normale menschliche Mikrobiota der Haut und Nasenhöhle gefunden werden. Es gibt fünf Organismen, die als potenzielle menschliche Krankheitserreger in dieser Gattung zu betrachten sind: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophiticus, S. haemolyticus und S. hominis, aber die ersten drei sind die häufigsten Isolate. S. aureus wird oft als der problematischste der drei Krankheitserreger angesehen und unterscheidet sich von den beiden anderen dadurch, dass er der einzige ist, der Plasma koagulieren kann. S., aureusist in der Lage, viele oberflächliche pyogene (eiterbildende) Infektionen der Dermis und der darunter liegenden Gewebe sowie schwere systemische Infektionen zu verursachen. Es kann eine Reihe von Toxinen produzieren, darunter Enterotoxine (Lebensmittelvergiftung), Zytotoxine (allgemeine systemische Toxine) und toxische Schock-Superantigene. Die anderen Koagulase-negativen Staphylokokken (S. epidermidis und S. saprophiticus) werden viel seltener als Krankheitserreger gefunden, sind jedoch gelegentlich mit Endokarditis,Gelenkprothesen und Wundinfektionen verbunden, um nur einige zu nennen.,
Diese Übung gibt Ihnen die Möglichkeit, selektive Medien zu verwenden, in diesem Fall basierend auf hohem Natriumchlorid (MSA und SM1 10 sind beide selektive Medien zur Isolierung von Staphylokokken – 7,5% NaCl). Ein selektives Medium hat ein inhibitorisches Mittel, das das Wachstum bestimmter Bakterien begünstigt, indem es andere hemmt. MSA enthält einen zusätzlichen Indikator für die Überwachung Mannitol Fermentation, das macht es ein differentielles Medium auch., Von den Bakterien, die in Gegenwart von hohem NaCl wachsen können, sind einige halophil (erfordern eine bestimmte Salzkonzentration, um zu wachsen), während andere halodurisch sind (verwenden Sie das Salz nicht, können es aber vertragen). Staphylococcusist nicht halophil, sondern eher halodurisch, da es in hohen NaCl-Konzentrationen leben oder ertragen kann. Der hohe Salzgehalt in SM1 10 und MSA hemmt andere häufige Hautmikroorganismen. Die anderen Medien, die in dieser Übung verwendet werden, sind zur Unterscheidung von pathogenen Staphylokokken von nicht pathogenen und zur Identifizierung der Spezies.,
Nicht nur salzresistent, Staphylokokken sind immer fakultativ anaerob. Wenn es gefärbt ist, wird es in kleinen Clustern (Staphylo = Cluster) gesehen. Staphylococcus ist normalerweise entweder Beta-hämolytisch oder überhaupt nicht hämolytisch (Gamma-Hämolyse genannt). Pathogene Staphylokokken können eine Vielzahl von Virulenzfaktoren hervorrufen, darunter Toxine, Koagulase, Leukocidine und hydrolytische Enzyme, die das Wirtsgewebe schädigen können.
Blut-agar (BAP) wird mit 5% schafsblut. Es ist ein übliches Medium, das zur Kultivierung von Bakterien verwendet wird, weil:
- Es ist ein großartiges Anreicherungsmedium für anspruchsvolle Bakterien.,
- Die Hämolyse von Blutzellen kann als Identifikationstest sehr nützlich sein.
CNA-agar ist eine Art von Blut-agar. Der einzige Unterschied ist, dass CNA ein Antibiotikum, Naladixsäure, hat, das Grambakterien hemmt.
Hämolyse ist der Abbau roter Blutkörperchen. Hämolysine sind Enzyme, die von einigen Bakterien produziert werden und in das Medium um die Bakterienkolonie freigesetzt werden. Es kann ein vollständiger Abbau der Zellen sein, mit der Freisetzung von Hämoglobin und einer Reinigung des Roten aus dem umgebenden Medium um die Kolonie herum., Oder die Hämolyse kann ein teilweiser Zusammenbruch sein, der zu einer grünlichen oder grün-gelben Zone um die Kolonie führt.,i>
SCHEMA DES IDENTIFIZIERUNGSVERFAHRENS
1.Sitzung ⇒ 2. Sitzung ⇒ 3. Sitzung ⇒ 4. Sitzung
CNA-DNase-Koagulase Führen Sie andere erforderliche Tests durch Identifizieren Sie Arten
MSA SM110 ONPG
Katalase Oxidase
Gramm Phenol rot Lactose
Fleck Brühe
DIE VERFAHREN
Hinweis
Achten Sie darauf, eine Liste aller Testergebnisse für Ihre Isolate zu halten.,
1. Session
- Jede Tabelle wird gegeben werden eine Staphylokokken-Arten wachsen auf aNA oder TSA-Platte.
- Mit einer Isolationsstreifen-Technik die Columbia-Naladixinsäure (CNA) inokulieren und die Novobiocin-Scheibe in Abschnitt 1 platzieren.
- Die Novobiocin-Empfindlichkeit ist ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal unter einigen Staphylokokkenarten. Legen Sie eine Pinzette in den Alkohol und sterilisieren Sie die Pinzette, indem Sie sie schnell durch die Flamme laufen lassen. Der Alkohol fängt Feuer und wenn er von der Pinzette verdampft wird, sind sie steril., Sie können nun eine Novobiocin-Scheibe aus dem Halter auswählen, um sie auf die CNA—Platte zu legen-im ERSTEN Streak-Abschnitt (wo das Bakterium konfluent wächst).
- Für die anderen Agarplatten–SM 110-Platte, Mannitol-Salz-Agar (MSA)—Platte, DNase-Agar-Platte-eine Impflinie in der Mitte der Platte ist ausreichend für Wachstumsergebnisse.
- Medien bei 37°C inkubieren
- Oxidase – und Katalasetests an Plattenkultur durchführen.
- Gram färbt das Isolat, um Form und Anordnung sowie Gram-Reaktion zu erhalten.
- Wir werden den ONPG-Test in der nächsten Sitzung durchführen., Dieser Test erfordert das Einschalten einer Reihe von Genen, des Lac-Operons. Um diese Aktivität zu induzieren, muss das Bakterium Laktose ausgesetzt werden. Aus diesem Grund werden Sie auch eine Tube Phenol-rote Laktosebrühe impfen.
2. Sitzung
- Gehen Sie zu einzelnen Laborübungen, um den Mannitolsalz-und DNase-Test zu interpretieren (erfordert HCl).
- Auf der CNA-Platte prüfen Sie auf 2 Reaktionen – – – Empfindlichkeit gegenüber Novobiocin-Antibiotikum UND Hämolyse von Blut.,
- Novobiocin – Empfindlichkeit–Eine Zone von 17 mm zeigt Empfindlichkeit an
- Hämolytische Reaktionen :
- alpha (α) Hämolyse–grüne Zone um die Kolonie, verursacht durch undichtes Hämoglobin, das in Biliverdin umgewandelt wird, genannt partielle Hämolyse
- beta (β) Hämolyse – vollständige Reinigung um die Kolonie, verursacht durch Streptolysin-Enzyme
- Gamma (γ) Hämolyse-keine Hämolysine, keine Zone
- Staphylokokkenarten sind entweder Beta-hämolytisch oder gamma (nicht hämolytisch)., Staph aureus produziert Alpha-Toxin, das typischerweise breite Zonen der Beta (vollständige) Hämolyse verursacht.
- Überprüfen Sie den Abstrich auf Wachstum und Pigment. Nährstoffe und Vitamine in diesem Medium verbessern die Pigmentierung des pathogenen Staphylokokken, wobei diese Kolonien zu einer gelb-orangen Kolonie werden.
- Führen Sie den Koagulasetest aus: Für diesen Test gibt es eine verknüpfte Übung. Es gibt nur wenige Staphylokokkenarten, die für den Koagulasetest positiv sind (siehe Tabelle unten), und S. aureus ist am häufigsten., Da gibt es 2 Arten von Koagulase-Enzym-gebunden und frei—es gibt 2 verschiedene Tests, die verwendet werden können, um diese Enzyme zu identifizieren. Die Röhrenmethode ist der endgültige Test der 2, der zuverlässigsten. Die Coagulase-Testübung im Laborhandbuch beschreibt diese 2 Versionen klar.
- Der ONPG-Test wird ausgeführt. Suchen Sie in Ihren Laborübungen für diesen Test nach den Anweisungen zum Ausführen des Tests. Da sich sehr wenig Flüssigkeit in der Röhre befindet, möchten Sie die Oberseite der Röhre mit Parafilm abdecken und dann die Röhre darüber legen. Dies reduziert die Austrocknung.,
3. Sitzung
- Die Haupttestreaktion zur Verwendung bei der Staphylococcus—Identifizierung ist die Koagulase-Testreaktion, die die Gattung Staphylococcus in 2 Gruppen unterteilt-Koagulase-negative Spezies und Koagulase-positive Spezies. Die Testmedien, die Sie zur Identifizierung ausführen, hängen davon ab, in welche Kategorie Ihr Organismus fällt. Möglicherweise möchten Sie einige der folgenden Tests ausführen.,
- Available media:
- arginine and ornithine
- decarboxylase broths
- urea broth
- ONPG
- sucrose, trehalose, maltose sugars
- VP broth
- nitrate broth
- If you have a coagulase positive Staph, there are only a few species available as your choice: there is a table with those species below.,
- Wenn Ihr Blut Koagulase-negativ ist, überprüfen Sie das Flussdiagramm unten sowie das Bergey-Handbuch oder andere Identifikationsbücher.
- Führen Sie die erforderlichen Tests zur Identifizierung durch. ES LIEGT AN IHNEN ZU BESTIMMEN, WELCHE ZUSÄTZLICHEN TESTS FÜR EINE KLARE IDENTIFIZIERUNG AUSGEFÜHRT WERDEN SOLLEN.
4. Sitzung
- Lesen Sie alle Tests aus der letzten Sitzung (siehe Laborübungen für Informationen zu Testinterpretationen.
- Schreiben Sie einen Bericht für Ihre Staphylococcus-Spezies Identifizierung, wenn Ihr Lehrer Sie dazu anweist.,
| Tube coagulase | Acid from trehalose | VP test | ONPG test | |
| S. aureus | + | + | + | – |
| S. intermedius | + | + | – | + |
| S., hyicus | variable | + | – | – |
| S. schleiferi | + | – | + | ? |
Common coagulase negative Staphylococcal species
| S. aureus | S. epidermidis | S. saprophiticus | |
| Alpha toxin (ß-hemolysis) | + (most strains) | – | – |
| Growth on 7.,acace93570″>DNase production | + (usually) | – | – |
| Sensitivity to novobiocin | sensitive | sensitive | resistant |
* Novobiocin sensitivity = >17mm zone size
QUESTIONS
- Which type of hemolysis is often associated with pathogenicity?,
- Was sind die Unterscheidungsmerkmale der Gattung Staphylococcus?
- Können Sie die Testreaktion von S. aureus für jeden der wichtigsten Tests geben – – – MSA, SM110, Koagulase, Katalase, Oxidase und DNase?
- Was passiert mit RBCs in der Beta-und Alpha-Hämolyse?
Mitwirkende und Zuschreibungen
-
Jackie Reynolds, Professorin für Biologie (Richland College)
