Cíle
- seznámit se s speciace rodu Staphylococcus.
- pěstujte a identifikujte různé druhy stafylokoků pomocí selektivního a diferenciálního agaru
- Identifikujte 3 hemolytické typy na krevním agaru.,
Staphylococcus je rod Gram +, nonspore tvořící koky čeledi Micrococcaceae, které se často vyskytují jako normální lidské mikroflóry kůže a nosní dutiny. Existuje pět organismy, aby zvážila, jako potenciální lidské patogeny v tomto rodu: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophiticus, S. haemolyticus a S. hominis, ale první tři jsou nejčastější izoláty. S. aureus je často považován za nejproblematičtější ze tří patogenů a odlišuje se od ostatních dvou tím, že je jediný schopen koagulovat plazmu. S., aureusis schopen způsobit mnoho povrchové pyogenní (hnis tvořící), infekcí kůže a hlubších tkání, stejně jako závažné systémové infekce. Může produkovat řadu toxinů včetně enterotoxinů (otravy jídlem), cytotoxinů (obecné systémové toxiny) a superantigenů toxického šoku. Ostatní koaguláza-negativní stafylokoky (S. epidermidis a S. saprophiticus) jsou mnohem méně často vyskytují jako patogeny, ale jsou občas spojené s endokarditidou, protetickou kloubu infekce a infekce ran, jen abychom jmenovali alespoň některé.,
Toto cvičení vám dává možnost použít selektivní média, v tomto případě založena na vysoké chlorid sodný (MSA a SM1 10 jsou oba selektivní médium pro izolaci Stafylokoků – 7.5% NaCl). Selektivní médium má inhibiční činidlo, které podporuje růst určitých bakterií inhibicí ostatních. MSA obsahuje další indikátor pro sledování mannitol fermentace, což z něj činí diferenciální média také., Bakterie, které mohou růst v přítomnosti vysokých NaCl, některé jsou halofilních (vyžadující určité koncentraci soli růst), zatímco jiné jsou haloduric (nepoužívejte sůl, ale můžete tolerovat). Stafylokoknení Halofilní, ale spíše halodurická, protože může žít nebo vydržet vysoké koncentrace NaCl. Vysoký obsah soli v SM1 10 a MSA inhibuje další běžné kožní mikroorganismy. Ostatní média používaná v tomto cvičení jsou pro odlišení patogenních stafylokoků od nepatogenních a pro identifikaci druhu.,
nejen odolný vůči soli, stafylokok je vždy fakultativně anaerobní. Po obarvení bude vidět v malých klastrech (stafilo = cluster). Staphylococcus je obvykle buď beta hemolytický nebo vůbec hemolytický (nazývaný gama hemolýza). Patogenní stafylokoky mohou produkovat řadu virulenčních faktorů, včetně toxinů, koagulázy, leukocidinů a hydrolytických enzymů, které mohou poškodit hostitelské tkáně.
krevní agar (BAP) se vyrábí s 5% ovčí krví. Je to běžné médium používané ke kultivaci bakterií, protože:
- je to skvělé obohacovací médium pro náročné bakterie.,
- hemolýza krevních buněk může být velmi užitečná jako identifikační test.
CNA agar je typ krevního agaru. Jediným rozdílem je, že CNA má antibiotikum, kyselinu naladixovou, která inhibuje gram-bakterie.
hemolýza je rozpad červených krvinek. Hemolyziny jsou enzymy produkované některými bakteriemi a uvolňují se do média kolem bakteriální kolonie. Může to být úplné zhroucení buněk, s uvolněním hemoglobinu a vyčištěním červené z okolního média kolem kolonie., Nebo hemolýza může být částečným rozpadem, což má za následek zelenožlutou nebo zelenožlutou zónu kolem kolonie.,i>
SCHÉMA IDENTIFIKACE POSTUP
1. zasedání ⇒ 2. zasedání ⇒ 3. zasedání ⇒ 4. sezení
CNA Dnázy Koaguláza Spustit další potřebné testy, Určit druh,
MSA SM110 ONPG
Kataláza Monoaminooxidázy,
Gram Fenolové červeně laktóza
Skvrna Vývar
ŘÍZENÍ
Poznámka:
ujistěte se, aby seznam všech výsledků zkoušek pro vaše izolátů.,
1st Session
- každá tabulka bude mít stafylokokový druh rostoucí na desce aNA nebo TSA.
- pomocí techniky izolačního pruhu naočkujte kyselinu kolumbijskou naladixovou (CNA) a umístěte disk novobiocinu do oddílu 1.
- citlivost Novobiocinu je klíčovým rozlišovacím znakem u některých druhů Staphylococcus. Umístěte kleště do alkoholu a poté sterilizujte kleště rychlým spuštěním plamene. Alkohol se zapálí a když se odpaří z kleští, budou pak sterilní., Nyní můžete vybrat novobiocin disk z držáku umístit na CNA plech—v PRVNÍ sérii oddíle (tam, kde bude splývající růst bakterií).
- Pro další agar desek-SM 110 deska,mannitol salt agar (MSA) deska, Dnázy agarem—očkování řádek dolů středu desky je dostatečné pro růst výsledků.
- inkubujte média při 37°C.
- spusťte oxidázu a katalázu na kultivaci desek.
- Gram skvrnu izolát získat tvar a uspořádání, stejně jako gram reakce.
- v další relaci provedeme test ONPG., Tento test vyžaduje zapnutí sady genů, Lac operon. K vyvolání této aktivity musí být bakterie vystavena laktóze. To je důvod, proč budete také naočkovat zkumavku fenolového červeného laktózového vývaru.
2. Sezení
- Přejít na jednotlivé laboratorní cvičení interpretovat mannitol salt a test Dnázy (vyžaduje HCl).
- na desce CNA kontrolujete 2 reakce – – – citlivost na novobiocinové antibiotikum a hemolýzu krve.,
- Novobiocin citlivost – pásmo 17 mm udává citlivost
- Hemolytická reakce :
- alfa (α) hemolýza–zelené zóny kolem kolonií, způsobené úniku hemoglobinu převedeny na biliverdin, který se nazývá částečná hemolýza
- beta (β) hemolýza–kompletní vymazání kolem kolonie způsobená rozpadem červených Krvinek pomocí enzymů streptolysin
- gama (γ) hemolýza – ne hemolysins, žádné zóny
- Staphylococcus druhy jsou buď beta hemolytické a gama (ne hemolytická)., Staph aureus produkuje alfa toxin, který obvykle způsobuje široké zóny beta (úplné) hemolýzy.
- zkontrolujte růst SM 110 a pigment. Živiny a vitamíny v tomto médiu zvyšují pigmentaci patogenních stafylokoků, tyto kolonie se stávají ažlutooranžovou kolonií.
- spusťte test koagulázy: pro tento test Existuje související cvičení. Existuje pouze několik druhů stafylokoků, které jsou pozitivní pro koagulázový test (viz tabulka níže) a s.aureus je nejčastější., Vzhledem k tomu, že existují 2 druhy enzymu vázané na koagulázu a volné—–existují 2 různé testy, které lze použít k identifikaci těchto enzymů. Metoda trubice je definitivní zkouškou 2, nejspolehlivější. Testovací cvičení koagulázy v laboratorní příručce jasně popisuje tyto 2 verze.
- bude spuštěn test ONPG. Podívejte se do svých laboratorních cvičení pro tento test na pokyny, jak spustit test. Vzhledem k tomu, že v trubici je velmi málo kapaliny, budete chtít zakrýt horní část trubice parafilm a poté nad ní umístit trubku. To snižuje dehydrataci.,
3. Sezení
- hlavní test reakce na použití v Staphylococcus identifikace je koaguláza test reakce, která rozděluje rodu Staphylococcus do 2 skupin—koaguláza negativní druhy a koaguláza pozitivní druhy. Testovací médium, které spustíte pro identifikaci, závisí na tom, do které kategorie spadá váš organismus. Možná budete chtít spustit některé z následujících testů.,
- Available media:
- arginine and ornithine
- decarboxylase broths
- urea broth
- ONPG
- sucrose, trehalose, maltose sugars
- VP broth
- nitrate broth
- If you have a coagulase positive Staph, there are only a few species available as your choice: there is a table with those species below.,
- pokud jsou vaše organismy negativní koagulázou, zkontrolujte níže uvedený diagram, jakož i Bergeyho příručku nebo jiné identifikační knihy.
- proveďte nezbytné testy pro identifikaci. JE NA VÁS, ABYSTE ZJISTILI, JAKÉ DALŠÍ TESTY JE TŘEBA PROVÉST PRO JASNOU IDENTIFIKACI.
4th Session
- Read any tests from last session (viz laboratorní cvičení pro informace o interpretacích testů.
- napište zprávu o identifikaci druhu Staphylococcus, pokud vás k tomu váš instruktor nasměruje.,
| Tube coagulase | Acid from trehalose | VP test | ONPG test | |
| S. aureus | + | + | + | – |
| S. intermedius | + | + | – | + |
| S., hyicus | variable | + | – | – |
| S. schleiferi | + | – | + | ? |
Common coagulase negative Staphylococcal species
| S. aureus | S. epidermidis | S. saprophiticus | |
| Alpha toxin (ß-hemolysis) | + (most strains) | – | – |
| Growth on 7.,acace93570″>DNase production | + (usually) | – | – |
| Sensitivity to novobiocin | sensitive | sensitive | resistant |
* Novobiocin sensitivity = >17mm zone size
QUESTIONS
- Which type of hemolysis is often associated with pathogenicity?,
- jaké jsou charakteristické rysy rodu Staphylococcus?
- můžete dát testovací reakci s. aureus pro každý z hlavních testů run – – – MSA, SM110, koaguláza, kataláza, oxidáza a Dnáza?
- co se stane s RBC v beta a alfa hemolýze?
Přispěvatelé a Pravomocí
-
Jackie Reynolds, Profesor Biologie (Richland College)
