DISKUSE
Gramovo barvení je nejrozšířenější postup barvení v bakteriologii. Nazývá se diferenciální skvrna, protože rozlišuje mezi grampozitivními a gramnegativními bakteriemi. Bakterie, které skvrny fialové s Gram barvení postup se nazývá Gram-pozitivní; ty, které skvrna růžové jsou řekl, aby byl Gram-negativní. Pojmy pozitivní a negativní nemají nic společného s elektrickým nábojem, ale jednoduše označují dvě odlišné morfologické skupiny bakterií.,
Gram-pozitivní a gramnegativní bakterie se zbarvují odlišně kvůli zásadním rozdílům ve struktuře jejich buněčných stěn. Bakteriální buněčná stěna slouží k tomu, aby organismus získal svou velikost a tvar, stejně jako k prevenci osmotické lýzy. Materiál v bakteriální buněčné stěně, který poskytuje tuhost, je peptidoglykan.
V elektronové mikroskopie, Gram-pozitivní buněčné stěny se jeví jako široké, husté zdi 20-80 nm silná a skládá se z mnoha propojené vrstvy peptidoglykanu (obrázky 1A a 1B). Chemicky je 60 až 90% Gram-pozitivní buněčné stěny peptidoglykan., Protkané v buněčné stěně Gram-pozitivních jsou teichoové kyseliny. Teichoové kyseliny, které procházejí a přesahují zbytek buněčné stěny, se skládají z polymerů glycerolu, fosfátů a ribitolu z cukerného alkoholu. Některé mají připojený lipid (kyselina lipoteichová). Vnější povrch peptidoglykanu je posetý bílkovinami, které se liší kmenem a druhem bakterie.,
Gram-negativní buněčné stěny, na druhé straně, obsahuje pouze 2-3 vrstvy peptidoglykanu a je obklopen vnější membrány složené z fosfolipidů, lipopolysacharid, lipoproteinů a proteinů (Obrázky 2A a 2B). Pouze 10% – 20% gramnegativní buněčné stěny je peptidoglykan. Fosfolipidy jsou umístěny hlavně ve vnitřní vrstvě vnější membrány, stejně jako lipoproteiny, které spojují vnější membránu s peptidoglykanem., Lipopolysacharidy, umístěné ve vnější vrstvě vnější membrány, sestávají z lipidové části zvané lipid a vložené do membrány a polysacharidové části vystupující ven z bakteriálního povrchu. Vnější membrána také obsahuje řadu proteinů, které se liší od kmene a druhu bakterie.,
Pro další informace na Gram-negativní a Gram-pozitivní buněčné stěny, viz následující výukové Objekty ve své Přednášce Průvodce:
- Prokaryotické Buňky Stěny; blok 1, Sekce IIB2
- Gram-Pozitivní Buněčné Stěny; blok 1, Sekce IIB2a
- Gram-Negativní Buněčné Stěny; Jednotka 1, Oddíl IIB2b
Gram barvení postup zahrnuje čtyři základní kroky:
1. Bakterie jsou nejprve obarveny základní barvicí krystalovou fialkou. Grampozitivní i gramnegativní bakterie se po tomto kroku přímo obarví a vypadají fialově.,
2. Bakterie jsou pak ošetřeny roztokem gram jodu. To umožňuje, aby se skvrna lépe zachovala vytvořením nerozpustného krystalově fialově-jodového komplexu. Grampozitivní i gramnegativní bakterie zůstávají po tomto kroku fialové.
3. Poté se přidá gram dekolorizátor, směs ethylalkoholu a acetonu. Toto je diferenciální krok. Gram-pozitivní bakterie udržet crystal violet-jód komplex, zatímco gramnegativní se odbarví.
4. Nakonec se aplikuje protizávaží safranin (také základní barvivo)., Od Gram-pozitivní bakterie jsou již obarvené fialové, nejsou ovlivněny counterstain. Gramnegativní bakterie, které jsou nyní bezbarvé, jsou přímo obarveny safraninem. Tak, Gram-pozitivní objeví fialová, a Gram-negativní objeví růžová.
© Daniel Cavanaugh, Značka Keen, autoři, Licencované pro použití, ASM MicrobeLibrary.,
v současné teorii za Gram barvení, to je si myslel, že v Gram-pozitivní bakterie, krystalovou violeť a jod dohromady tvoří větší molekula, která se vysráží uvnitř buňky. Alkohol/aceton směs pak způsobuje dehydrataci vícevrstvé peptidoglykanu, čímž se snižuje prostor mezi molekulami a způsobuje buněčnou stěnu, aby pasti crystal violet-jódový komplex v buňce., V případě gramnegativních bakterií směs alkoholu / acetonu, která je lipidovým rozpouštědlem, rozpouští vnější membránu buněčné stěny a může také poškodit cytoplazmatickou membránu, ke které je připojen peptidoglykan. Několik vrstev peptidoglykanu jsou schopni udržet crystal violet-komplex jódu a buňky odbarví.
je důležité si uvědomit, že Gram-pozitivita (schopnost udržet fialový krystal fialově-jodový komplex) není fenomén všeho nebo nic, ale otázkou stupně., Existuje několik faktorů, které by mohly mít za následek gram-pozitivní barvení organismu Gram-negativně:
1. Použitá metoda a techniky. Přehřátí při tepelném fixace, po odbarvování s alkoholem, a dokonce i příliš mnoho mytí s vodou mezi kroky, které mohou vyústit v Gram-pozitivní bakterie ztrácí crystal violet-jódový komplex.
2. Věk kultury. Kultury starší než 24 hodin mohou ztratit schopnost udržet krystalově fialově-jodový komplex.
3. Samotný organismus., Některé Gram-pozitivní bakterie jsou schopny udržet komplex krystalového fialového jódu než jiné.
proto je třeba při barvení Gram použít velmi přesné techniky a interpretovat výsledky s diskrétností.
tryptikázov agarem kultur Escherichia coli (malé, Gram-negativní bakterie) a Staphylococcus epidermidis (grampozitivní kok s staphylococcus uspořádání).
postup (provést individuálně)
1., Escherichia coli
. Teplo-oprava nátěru Escherichia coli takto:
1. Pomocí kapátka láhve deionizované vodě nalezené v barvicí stojan, umístěte 1/2 normální velikosti kapky vody na čistý snímek dotykem kapátka na podložní sklíčko (Obrázek 1). Altenately, pomocí sterilizované inokulační smyčky umístěte kapku deionizované vody na sklíčko.
2., Pomocí sterilní očkovat smyčky, asepticky odeberte malé množství kultury z agaru povrch a jemně dotknout to 2 – 3 krát do kapky vody, až se voda stává viditelně zakalená (Obrázek 2). Dobrý nátěr se správným množstvím bakterií je nezbytný pro gram barvení.
- příliš mnoho bakterií na snímku by mohlo vést k nedostatečné odbarvení; příliš málo by mohlo vést k nadměrné odbarvení.
3. Spalte zbývající bakterie na inokulační smyčce., Pokud se do vody přidá příliš mnoho kultury, neuvidíte obarvené jednotlivé bakterie a nemusíte mít spolehlivou gramovou skvrnu.
4. Poté, co se inokulační smyčka ochladí, rozložte suspenzi na přibližně polovinu snímku a vytvořte tenký film. Správně připravený nátěr se správným množstvím bakterií by měl vypadat podobně jako obr. 3.
5. Nechte tuto tenkou suspenzi zcela vyschnout na vzduchu (obrázek 4). Nátěr musí být zcela suchý, než je sklíčko tepelně fixováno!
6., Na teplo-fix bakterie na snímku,vyzvednout vzduch-sušené snímek s krycí sklíčko pinzetou a držet na spodní části snímku naopak nátěru poblíž otevření microincinerator dobu 10 sekund (Obrázek 5), jak dokazuje váš instruktor. Pokud není skluzavka dostatečně zahřátá, všechny bakterie se umyjí. Pokud je přehřátá, může dojít k poškození strukturální integrity bakterií.
b. skvrna Huckerovou krystalovou fialkou po dobu jedné minuty (obrázek 6). Jemně omyjte vodou (Obrázek 7). Odstraňte přebytečnou vodu, ale mezi kroky nevysušte.
c., Skvrna s roztokem gram jódu po dobu jedné minuty (Obrázek 8) a jemně omyjte vodou.
d. Odbarvujte zvednutím snímku a nechte gram ‚ s decolorizer běžet dolů skluzavkou, dokud fialová přestane proudit ve spodní části snímku (obrázek 9).
- ujistěte se, že celý nátěr je rovnoměrně odbarven a že nejste nedostatečně odbarvující nebo příliš odbarvující.
- ihned omyjte vodou.
e. skvrna se safraninem po dobu jedné minuty (obrázek 10)., Když jste smýt přebytečný safranin, být velmi opatrní, aby umýt jemně a krátce, jak je to možné umýt některé z sarfanin v bakterie.
f. osušte (obrázek 11) a pozorujte pomocí olejové ponorné mikroskopie.
2. Staphylococcus epidermidis
. Teplo-oprava nátěru Staphylococcus epidermidis takto:
1. Pomocí kapátka láhve deionizované vodě nalezené v barvicí stojan, umístěte 1/2 normální velikosti kapky vody na čistý snímek dotykem kapátka na podložní sklíčko (Obrázek 1)., Altenately, pomocí sterilizované inokulační smyčky umístěte kapku deionizované vody na sklíčko.
2. Pomocí sterilní očkovat smyčky, asepticky odeberte malé množství kultury z agaru povrch a jemně dotknout to 2 – 3 krát do kapky vody, až se voda stává viditelně zakalená (Obrázek 2).
- příliš mnoho bakterií na snímku by mohlo vést k nedostatečné odbarvení; příliš málo by mohlo vést k nadměrné odbarvení.
3. Spalte zbývající bakterie na inokulační smyčce., Pokud se do vody přidá příliš mnoho kultury, neuvidíte obarvené jednotlivé bakterie a nemusíte mít spolehlivou gramovou skvrnu.
4. Po naočkování smyčce ochlazuje, šíření suspenze přibližně polovinu snímku tvoří tenký film (Obrázek 3).
5. Nechte tuto tenkou suspenzi zcela vyschnout na vzduchu (obrázek 4). Nátěr musí být zcela suchý, než je sklíčko tepelně fixováno!
6., Na teplo-fix bakterie na snímku,vyzvednout vzduch-sušené snímek s krycí sklíčko pinzetou a držet na spodní části snímku naopak nátěru poblíž otevření microincinerator dobu 10 sekund (Obrázek 5), jak dokazuje váš instruktor. Pokud není skluzavka dostatečně zahřátá, všechny bakterie se umyjí. Pokud je přehřátá, může dojít k poškození strukturální integrity bakterií.
b. skvrna Huckerovou krystalovou fialkou po dobu jedné minuty (obrázek 6). Jemně omyjte vodou (Obrázek 7). Odstraňte přebytečnou vodu, ale mezi kroky nevysušte.
c., Skvrna s roztokem gram jódu po dobu jedné minuty (Obrázek 8) a jemně omyjte vodou.
d. Odbarvujte zvednutím snímku a nechte gram ‚ s decolorizer běžet dolů skluzavkou, dokud fialová přestane proudit ve spodní části snímku (obrázek 9).
- ujistěte se, že celý nátěr je rovnoměrně odbarven a že nejste nedostatečně odbarvující nebo příliš odbarvující.
- ihned omyjte vodou.
e. skvrna se safraninem po dobu jedné minuty (obrázek 10)., Když jste smýt přebytečný safranin, být velmi opatrní, aby umýt jemně a krátce, jak je to možné umýt některé z sarfanin v bakterie.
f. osušte a pozorujte pomocí olejové ponorné mikroskopie.
3. Ujistěte se, že použité barvivo pečlivě nalijete do zásobníku na barvení do nádoby na sběr odpadních barviv, nikoli do dřezu.
© Hussein Shoeb, autor. Licencováno pro použití, ASM MicrobeLibrary.
b., Skvrna kapsle
diskuse
mnoho bakterií vylučuje slizký, viskózní povlak nazývaný kapsle nebo glykokalyx . To se obvykle skládá z polysacharidu, polypeptidu nebo obojího.
schopnost produkovat kapsli je zděděnou vlastností organismu, ale kapsle není absolutně nezbytnou buněčnou složkou. Kapsle se často vyrábějí pouze za specifických podmínek růstu. I když to není pro život podstatné, kapsle pomáhají bakteriím přežít v přírodě., Kapsle pomáhají mnoha patogenním a normálním bakteriím flóry zpočátku odolávat fagocytóze hostitelskými fagocytárními buňkami. V půdě a vodě kapsle pomáhají zabránit tomu, aby bakterie pohltily prvoky. Kapsle také pomáhají mnoha bakteriím přilnout k povrchům, a tak odolávají propláchnutí. Umožňuje také mnoha bakteriím vytvářet biofilmy. Biofilm se skládá z vrstev bakteriálních populací ulpívajících na hostitelských buňkách a vložených do společné kapsulární hmoty.,
Pro další informace na bakteriální tobolky, viz následující výukové Objekty ve své Přednášce Průvodce:
- Glykokalyx (Kapsle) a S-Vrstvy; blok 1, Sekce IIB4a
- Schopnost Odolávat Fagocytární Zážehové; Jednotka 3, Oddíl B5b
ORGANISMUS,
Odstředěné Mléko, vývar kultury Enterobacter aerogenes. Odstředěné mléko dodává základní živiny pro výrobu kapslí a také poskytuje mírně zbarvitelné pozadí.
postup (provést individuálně)
1., Rozvířit Odstředěné Mléko, vývar kultury s vaší smyčky a místo 2-3 smyčky Enterobacter aerogenes na mikroskopické sklíčko.
2. Pomocí očkovací smyčky rozložte vzorek tak, aby pokryl asi jeden palec snímku.
3. Nechte jej úplně vyschnout na vzduchu. Nezahřívejte fix. Kapsle se dobře drží na skle a teplo může kapsli zničit.
4. Skvrna s krystalovou fialkou po dobu jedné minuty.
5. Přebytečné barvivo omyjte 20% roztokem síranu měďnatého.
6. Odstraňte přebytečný roztok síranu měďnatého a okamžitě osušte.
7. Sledujte pomocí olejové ponorné mikroskopie., Organismus a mléko sušené na skluzu vyzvednou fialové barvivo, zatímco kapsle zůstane bezbarvá.
8. Ujistěte se, že použité barvivo pečlivě nalijete do zásobníku na barvení do nádoby na sběr odpadních barviv, nikoli do dřezu.
9. Pozorujte demonstrační kapsli skvrny Streptococcus lactis, zapouzdřené bakterie, která je normální flórou v mléce.
a. Gram Barvení,
Make výkresy jednotlivých bakterií na Gram stain přípravy.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Skvrna tobolky
provede výkres přípravy kapslí na skvrny Enterobacter aerogenes a demonstrační kapsle skvrny Streptococcus pneumoniae.
Kapsle skvrna
Streptococcus lactis
