vyžaduje skutečné úsilí, aby vaše základní znalosti molekulární a buněčné biologie byly čerstvé, kromě všeho, co musíte udělat. Nebylo by skvělé, kdyby tam bylo místo, kde byste mohli najít snadno čitelné články, které vám umožní oprášit tyto základy během několika minut?
…doufám, že jste řekli „ano“, protože to je cíl mých „základů“: série článků, které již máme a budeme i nadále přinášet pravidelně. Tento článek vysvětluje základy ligace DNA.,
Vaše DNA Ligace Kámo: DNA Ligázy
DNA ligázy (ES 6.5.1.1) je enzym, v srdci DNA ligační reakce. To kovalentně připojí k fosfátové páteři DNA s tupými nebo kompatibilní kohezní konce (viz Obrázek 1) a je přirozené, že role je v opravě dvakrát zlomů v DNA molekuly. V molekulární biologii se běžně používá pro vložení fragmentů DNA generovaných restrikčními enzymy do vektorových páteří. Komerční ligázy jsou dodávány s reakčním pufrem obsahujícím ATP a Mg2+, které jsou nezbytné pro aktivitu ligázy., Vzhledem k tomu, že ATP může být poškozeno opakovanými cykly zmrazování a rozmrazování, je vhodné vytvořit alikvoty pufru (viz můj článek „5 tipů pro ligaci DNA“).
Obrázek 1. Soudržné a tupé konce, připravené k ligaci DNA!
dva kroky dna ligační reakce
samotná dna ligační reakce má dva základní kroky. Nejprve se konce DNA musí náhodně srazit a zůstat spolu dostatečně dlouho, aby se k nim ligáza připojila. To je nejvíce neefektivní část reakce, ale je snadnější při nízkých teplotách. Proč?, No, jak pravděpodobně budete vědět, všechny molekuly se pohybují rychleji při vyšších teplotách, takže si můžete představit, že to bude jednodušší pro dva konce DNA, aby se srazí a zůstat spolu, pokud jsou jemně plovoucí v roztoku při nízké teplotě, spíše než svištící o tom, jak by to bylo při vyšších teplotách. Pro soudržné konce existuje další důvod; nižší teploty stabilizují vodíkové spojení mezi komplementárními nukleotidy, což opravdu pomáhá udržovat věci na svém místě.
Obrázek 2., Enzymatická reakce dna ligace
druhým krokem je enzymatická reakce, která je schematicky znázorněna na obrázku 2.. Dna ligáza katalyzuje spojení 3′-OH S 5 ‚ – fosfátem pomocí dvoustupňového mechanismu. Za prvé, AMP nukleotid, který je připojen k lysinovému zbytku v aktivním místě enzymu, je převeden na 5‘-fosfát. Pak je amp-fosfátová vazba napadena 3 ‚ – OH, tvořící kovalentní vazbu a uvolňující zesilovač. Aby enzym mohl provádět další reakce, musí být AMP v aktivním místě enzymu doplněn ATP.,
Tady je důvod, proč jsme provedení DNA Ligace při nízkých teplotách může pomoci
DNA ligase enzym má optimální aktivitu při 25°C, takže ligační reakce se provádí při teplotě, která je trade-off mezi optimální teploty pro uvedení konce DNA k sobě (1°C) a enzymatické reakce (25°C). Normálně je 1h při 16 ° C v pořádku, ale protože spojování konců DNA je nejméně účinnou součástí reakce, která to zvýhodňuje snížením teploty na 4°C, může poskytnout ještě větší účinnost. Enzym však bude pracovat velmi pomalu při této teplotě tak dlouho (např., přes noc) je nutná inkubační doba.
původně publikováno dne 31. října 2007; aktualizováno a znovu Publikováno dne 5. Prosince 2014.
pomohlo vám to? Pak prosím podělte se se svou sítí.
