Objev Mitochondriální DNA
Některé pojmy si vědecký svět útokem, ale jiní dobýt ji až po mnoha šarvátkách. Objev mitochondriální DNA (mtDNA) patří do této druhé kategorie. Biochemici, histologové a elektronoví mikroskopové viděli DNA v mitochondriích po celá léta, ale většina z nich nebyla připravena na myšlenku, že tam DNA skutečně patří. To může vysvětlit, proč učebnicové účty mtDNA téměř nikdy neřeknou, jak byla tato DNA objevena.,
Po základní stavební plán eukaryotické buňky bylo odhaleno na počátku roku 1950 pomocí elektronové mikroskopie z Palade, Sjöstrand, a další, biochemici objal de Duve je dogma, že každá makromolekula měl jeden, a pouze jeden, intracelulární umístění. V analýze buněčných frakcí, cytochrom oxidáza byla přijata jako marker pro mitochondrie, nicotianamide adenin dinucleotidu fosfát (NADPH)–cytochrom c reduktázy pro endoplazmatického retikula, a DNA pro jádro., Vzhledem k tomuto rozpoložení je snadné pochopit, proč byla přítomnost DNA v mitochondriálních frakcích obecně přičítána kontaminaci jadernými fragmenty. Histochemické DNA skvrny, jako je Feulgen reakce, také obarví kinetoplasts z Trypanosomes a Nebenkern‘ hmyzu spermií, ale v té době to ještě nebylo známo, že tyto struktury byly, ve skutečnosti, neobvyklé mitochondrií., Obrovské množství mimojaderná DNA byly zjištěny také v cytoplazmě obojživelníků oocytů, ale trvalo mnoho let, si uvědomit, že tato DNA byla, ve skutečnosti, mtDNA, jejichž množství se odráží enormní množství mitochondrií v těchto velkých buněk. V roce 1961, na Pátém Výročním Zasedání Americké Společnosti pro Buněčnou Biologii v Chicagu, Hans Ris ukázal elektronové mikroskopie mitochondrií s inkluzí připomínající DNA obsahující nucleoids bakterií a dělal kacířský návrh, že mitochondrie (a také chloroplasty) obsahují vlastní DNA., V dokumentu, který se objevil v následujícím roce, Ris a Walter S Plaut dále dokumentovány a rozšířil tyto připomínky. Brzy poté biochemické a morfologické důkazy z několika skupin potvrdily přítomnost DNA v chloroplastech.
objev chloroplast DNA z biochemici se nový pohled na časné zjištění Margaret Mitchell a Boris Ephrussi, že některé mutace, které ovlivňují mitochondriální funkce v plísni Neurospora crassa a kvasinky Saccharomyces cerevisiae byly nedědí podle Mendelovy zákony., Zdálo lákavé spekulovat, že neznámý ‚extrachromosomal faktory se podílí tyto mutace byly, ve skutečnosti, mtDNA.
do roku 1962 byl důvod pro koncept mtDNA tak dobře připraven, ale samotný koncept nebyl obecně přijat. Zpětně se zdá, že vědecká komunita čekala na přesvědčivé studie, které zdokumentovaly existenci mtDNA několika různými metodami.
Jedna z těchto studií pochází z elektronové microscopists Margit MK Nass a Sylvan Nass, který byl pak pracuje v Wenner Gren Institutu na Univerzitě ve Stockholmu., Ukázali, že matice osmium-opravena kuřecích embryí mitochondrie obsažené nit-jako inkluze, jehož vzhled po různých fixačních postupů úzce paralelně, že z histonů-free DNA nukleoid bakterií: po fixaci s oxidem osmičelým, inkluze se objevil hrudkovitý a jako tyče o průměru ~400 Å; fixace tkání s oxidem osmičelým následuje léčba s uranyl acetát před dehydratací jim jeví jako 15-30-Å tenkých vláken., Ještě přesvědčivější důkaz pro přítomnost DNA v těchto inkluzí bylo zjištění, že inkluze může být odstraněna úpravou lehce pevné embryonální tkáně s Dnázy. Léčba pepsinem, Rnázou nebo kontrolami pufru bez Dnázy byla neúčinná. Jasnost těchto elektronových mikrografů a pečlivé kontroly, které byly zahrnuty, měly přesvědčivý dopad na buněčné Biology. MMK Nass a s Nass publikovali svou práci ve dvou dokumentech back-to-back v čísle časopisu Journal of Cell Biology z roku 1963., V té době však byla buněčná biologie a biochemie stále poněkud odlišnými disciplínami a většina biochemiků si neprohlédla časopisy věnované buněčné biologii. Trvalo tedy chvíli, než zjištění MMK Nass a s Nass vstoupily do vědomí biochemické komunity.
V přibližně stejné době, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy, a Schatz ve Biochemie Ústav na Univerzitě ve Vídni byly snaží najít biochemický základ pro extrachromosomal mutace, které zrušen respiračních funkcí u kvasinky S. cerevisiae., V časných 1960, mnozí biochemici byla stále zdráhají, aby zvážila ‚dýchacích granulí‘ kvasinek jako bona fide mitochondrií, který umístil výzkumu Haslbrunner et al. mimo hlavní proud mitochondriální biochemie ve Spojených státech a jinde.
pro hledání DNA v mitochondriích byl zvolen biochemický přístup. Kvasinkové mitochondrie byly čištěny pomocí nejlepších dostupných metod, a jejich obsah DNA byla měřena na čas-ctil ‚Diesche barva reakce., Před několika lety de Duve a spolupracovníci ukázali, že odstředění subcelulárních frakcí na rovnováhu v gradientu hustoty často poskytovalo čisté oddělení různých organel. Překvapivě obvyklé sacharózy přechody nebyla samostatná kvasinkové mitochondrie z jaderné fragmenty, ale když sacharóza byla nahrazena X-ray, kontrastní činidlo ‚Urografin‘, mitochondrie tvoří extrémně ostré kapely, a DNA byla přítomna pouze ve dvou frakcích: nejvíce byl na dně centrifugační zkumavky, a velmi malé množství, ale diskrétní vrcholu se shodoval přesně s tím mitochondrií., DNA ve spodní frakci byla snadno trávena Dnázou a zřejmě představovala jadernou DNA. DNA mitochondriální frakce byla snadno stravitelné, Dnázy, pokud organely byly poprvé přerušeny s trichloroctové; lze předpokládat, že je zastoupen DNA ohraničená mitochondriální membrány. Jeho koncentrace byla mezi různými experimenty velmi konstantní−mezi 1 a 4 µg mg-1 mitochondriálním proteinem. Urografin-purifikované mitochondrie z krysích jater, krysích ledvin a hovězího srdce – obsahovaly téměř 10krát méně DNA, mezi 0, 2 a 0, 6 µg DNA na mg proteinu., Typický savčí mitochondrion měl obsahovat 3 × 10-17 G DNA. Za předpokladu, že DNA byla dvouvláknová, nemohla kódovat více než 1,2 MDa polypeptidových řetězců. Tento výsledek byl považován za důležitý, protože pevně vyloučil možnost, že mtDNA kódovala všechny mitochondriální proteiny. Dnes, tento časný výpočet Haslbrunner et al. mohlo by to být zpochybněno z několika důvodů, přesto se to pozoruhodně přiblížilo realitě: 13 polypeptidy kódované savčí mtdnou mají celkovou hmotnost 0.,423 MDa, a zbytek kódování potenciál je do značné míry tvořily geny pro ribozomální a transferové Rna, stejně jako skutečnost, že mitochondrie mají obvykle více než jednu kopii své DNA genomu.
