Good Mood

Výsledky a Diskuse

Arabidopsis cDNA knihovny byl promítán pomocí 35S-označením CaM-závazné screening, jak je popsáno (24). Jeden z pozitivních klonů vykazoval v databázi shodnou nukleotidovou sekvenci s AtCat3 (GenBank no. U43147). Dokázat, že AtCat3 kódované CaM-vázající protein, plné kódování regionu AtCat3 byl subcloned do pET14b expresního vektoru. Rekombinantní AtCat3 byl indukován isopropyl β-d-thiogalaktosidem (IPTG) (obr., 1A) a byl čištěn cam afinitní chromatografií na téměř homogenitu. Celkový bakteriální extrakt byl použit pro test vázající CaM a bylo prokázáno, že vačka značená 35s se váže na protein AtCat3 v přítomnosti Ca2+ (obr. 1A). Po přidání EGTA nebyla pozorována žádná vazba vačky. Kromě toho, 35S-označené CaM se neváže na AtCat3 když CaCl2 byl nahrazen jiné dvojmocné kationty, jako MgCl2 či MnCl2 (Obr. 1A), což naznačuje, že vazba CaM na AtCat3 je závislá na Ca2+.

pro identifikaci vazebné oblasti CaM v AtCat3 byly pro 35s-cam-vazebné testy použity dva mutanty C-terminální delece. Za přítomnosti 0.,2 mm Ca2+, vačka se váže na divoký typ a mutant 1-451, zatímco vačka se neváže na mutant 1-414 (obr. 1B), což naznačuje, že oblast vázající CaM Pro AtCat3 je omezena na aminokyseliny 415-451. Pro další potvrzení vazby CaM na AtCat3 byl syntetický peptid odpovídající aminokyselinám 415-451 AtCat3 inkubován s CaM. Tvorba komplexu peptid-CaM byla hodnocena nedenaturing PAGE. Peptid 36-mer je schopen vytvořit stabilní komplex s vačkou za přítomnosti Ca2+ (obr. 1C). Při absenci peptidu byl pozorován jediný vačkový pás., Jak se koncentrace peptidu zvýšila, objevil se další pás s nízkou pohyblivostí, představující komplex peptide-CaM. Když byl molární poměr mezi peptidem a CaM 1:1, bylo zjištěno pouze komplexní pásmo peptidu a vačky, což naznačuje, že v peptidu je pouze jedno vazebné místo. V přítomnosti EGTA (obr. 1C). Tyto výsledky ukazují, že CaM se specificky váže na AtCat3 způsobem závislým na vápníku.

kataláza existuje téměř ve všech aerobních organismech. U zvířat existuje pouze jedna katalázová izoforma kódovaná jediným genem., Naproti tomu kataláza v rostlinách je přítomna jako více izoformů kódovaných malou genovou rodinou (6, 26). Alespoň to platí u monokotů, jako je kukuřice a dicots, jako je tabák, Arabidopsis a dýně, ve kterých je kataláza dobře charakterizována. Zajímavé je, že každý z nich má tři izoformy kódované třemi geny. K určení, zda všechny katalázy mají oblasti vázající CaM, byly porovnány aminokyselinové sekvence 37 kataláz z bakterií, zvířat a rostlin pomocí programu pileup v balení GCG10., Srovnání sekvencí aminokyselin odhalilo velmi vysokou homologii v n-terminálu 384 aa (asi 60% podobnost a 50% identita). V C-terminálu 108 aa, kde se nachází Oblast vázající CaM, však byla velmi malá podobnost mezi AtCat3 a jinými nerostlinnými katalázami (asi 21% homologie a 14% identita). Nicméně všechny rostlinné katalázy vykazovaly v této části vysokou homologii (asi 78% homologie a 70% identita), zejména v oblasti odpovídající oblasti vazby CaM v AtCat3. Obr. 2 ukazuje C-terminál 108-AA sekvenční srovnání 13 reprezentativních kataláz., I když sekvencí aminokyselin v charakterizován CaM-vazebné proteiny nejsou zachovány v CaM-závazné regionu, většina z nich má sekundární strukturální funkce, základní amfifilní α-šroubovici (27), jako je auxin-regulovaný protein ZmSAUR1 (24) a rostlina chimerická Ca2+/CaM protein kináz (28). Všimněte si, že v oblastech vázajících CaM jsou často negativně nabité aminokyseliny, ale čistý náboj je pozitivní (16). Na základě spirálového kola projekce pomocí GCG program, bylo zjištěno, že aminokyseliny 438-451 v AtCat3 jsou schopny tvořit základní amfifilní α-šroubovici., Je zřejmé, že jedna strana spirálového kola je hydrofobní a druhá strana je hydrofilní s čistými kladnými náboji. Analýza aminokyselinových sekvencí odpovídajících vačkové vazebné oblasti AtCat3 předpověděla existenci základní amfifilní α-šroubovice v některých jiných rostlinných katalázách. Zajímavé je, že mezi tři kataláza izoforem v kukuřice, tabák, Arabidopsis, a dýně, tam je alespoň jedna izoforma s amfifilní α-helikální struktury v jednotlivých druzích, např.,, tobacco1 (aminokyseliny 431-444), maize3 (aminokyseliny 442-455), a pumpkin1 (aminokyseliny 438-451), stejně jako Arabidopsis AtCat1 (aminokyseliny 438-451). Zda to platí pro všechny druhy rostlin, není jasné vzhledem k omezené kataláza sekvence pro jiné druhy rostlin v GenBank. Na základě krystalové struktury dat z bakteriálních a savčích catalases, α-šroubovice jsou typické struktury v C-terminální části těchto catalases (29), ale ne základní amfifilní α-helikální strukturu, existuje v této části podle spirálové kolo projekce.,

test, zda CaM váže na čištěný kataláza od planta, tabák katalasy byl čištěný z listů na základě Durner a Klessig (10). Jako poslední krok v procesu čištění byl použit sloupec CaM-Sepharose. Souhrn kroků čištění katalázy s použitím 1 000 g tabákových listů je uveden v tabulce 1. Tabáková kataláza byla čištěna na téměř homogenitu, jak je posuzováno podle SDS / PAGE a barvení stříbrem (obr. 3, pruh 1). Katalázová identita byla potvrzena západním blotováním mAb proti tabákové kataláze (obr. 3, pruh 3)., Vazba CaM na vyčištěnou tabákovou katalázu byla prokázána následujícími přístupy. i) pro čištění tabákové katalázy byla použita kolona CaM-Sepharose. Míra zotavení pro tento krok byla 81% (Tabulka 1), což naznačuje, že většina katalázy z tabákových listů je protein vázající CaM. (ii)vačka značená 35s byla použita k testování vazby na čištěnou katalázu za přítomnosti 0,2 mM CaCl2 (obr. 3, pruh 5). Jako ovládací prvek byl použit rekombinantní AtCat3 (obr. 3, pruhy 2, 4 a 6). Přidání 0.,4 mM EGTA zrušila vázání vačky, což naznačuje, že vačka se váže na rostlinnou katalázu závislým způsobem Ca2+. Byly také provedeny testy vázající CaM, aby se zjistilo, zda se váže na houbovou, hovězí nebo lidskou katalázu. Výsledky ukázaly, že žádná z těchto nerostných kataláz nevykazovala žádnou vazbu vačky (data nejsou zobrazena), což je v souladu se srovnáváním sekvencí aminokyselin (obr. 2).,

CaM-vazebné místo, nebo úzce navazujících oblastí v jiné vyznačuje CaM-vazebné proteiny často fungují jako autoinhibitory nebo pseudosubstrate domén. Tato oblast udržuje cílové proteiny v neaktivním stavu v nepřítomnosti Ca2+ signál, například v rostlinných chimerická Ca2+/CaM dependentní protein kinázy (30) a glutamát dekarboxylázou (31). Pro studium významu vazby CaM na rostlinné katalázy byly měřeny katalytické aktivity rekombinantního AtCat3 a čištěné tabákové katalázy v přítomnosti a nepřítomnosti CaCl2 a CaM., Podobné experimenty byly také prováděny za použití jiných nerostných kataláz. Rekombinantní AtCat3 exprimovaný E. coli nevykazoval žádnou aktivitu. Podobné výsledky byly získány v jiné laboratoři (Zhixiang Chen, osobní komunikace). To může být výsledkem selhání tvořit správnou strukturu pro rekombinantní kataláza, protože aktivní kataláza je tetramer tvořený čtyřmi stejných nebo podobných podjednotek (6, 10, 26). Naproti tomu vyčištěná tabáková kataláza vykazovala významnou změnu aktivity závislé na Ca2+/CaM během kroků čištění (Tabulka 1)., Stimulační účinky Ca2+/CaM je asi 2,2-krát v každém kroku, s výjimkou vzorku, který byl získán po CaM-Sepharose chromatografická. Vykazovala vyšší stimulaci katalázové aktivity (2,5 násobně) možná kvůli odstranění katalázové frakce bez vazby Ca2+ / CaM (Tabulka 1). Non-Ca2+/CaM-závazné kataláza frakce specifická aktivita 59.6 jednotek (bazální aktivita). Ca2+ / CaM však nestimuloval aktivitu této frakce katalázy (data nejsou zobrazena)., Tyto výsledky ukazují, že Ca2+/CaM je schopen aktivovat tabáku katalasy ve frakci, která byla získána po CaM-Sepharose chromatografická, což odpovídá CaM-závazné výsledky. Pro porovnání účinků Ca2+ / CaM na aktivitu kataláz z různých zdrojů byla použita relativní aktivita, protože existuje významný rozdíl ve specifické aktivitě kataláz z různých druhů. Například A. niger kataláza má specifickou aktivitu 5,7 jednotek; kataláza z jaterních jater, 51,9 jednotek; lidské erytrocyty, 39,5 jednotek; tabáková kataláza, 63.,1 jednotky (v nepřítomnosti Ca2+/CaM). Obr. 4A ukazuje, že samotný CaCl2 nebo samotný CaM neměly žádný stimulační účinek na aktivitu tabákové katalázy (asi 40% maximální aktivity). Žádný rozdíl v katalytické aktivitě nebyl pozorován u houbových, hovězích nebo lidských kataláz v přítomnosti nebo nepřítomnosti Ca2+, CaM a Ca2+ / CaM(obr. 4A). Nahrazením CaCl2 MgCl2 nedošlo k žádné významné změně aktivity tabákové katalázy v přítomnosti nebo nepřítomnosti CaM (data nejsou zobrazena)., Pro další zdokumentování účinku Ca2+ / CaM na aktivitu rostlinné katalázy bylo do každé reakční směsi přidáno 10 µM peptidu odpovídajícího oblasti vazby na CaM AtCat3 (415-451). Nerostlinné katalázy nebyly přidáním peptidu ovlivněny. Stimulační účinek Ca2+ / CaM na aktivitu tabákové katalázy však byl zrušen přidáním peptidu (obr. 4A). Kromě toho inhibiční účinek peptidu na aktivitu tabákové katalázy závisel na koncentraci peptidu (obr. 4B)., Katalázová aktivita byla inhibována asi o 58%, což je blízké bazální aktivitě katalázy. Peptid však neměl žádný vliv na aktivitu bovinní katalázy ve všech testovaných koncentracích (obr. 4A). Tyto výsledky naznačují, že Ca2+ / CaM má stimulační účinek na čištěnou rostlinnou katalázu, ale nemá žádný vliv na nerostné katalázy.

je známo, že kataláza je převládající peroxizomální enzym, ale existuje také v mitochondriích a cytoplazmě (32). Například kukuřice Cat3, která může být katalázou vázající cam na základě srovnání sekvencí aminokyselin, je mitochondriální protein (33). Naše výsledky (obr. 1-4) prokázat, že CaM se váže na rostlinnou katalázu a reguluje její aktivitu. Prokázat přítomnost tohoto regulační aktivitu in vivo, jsme studovali, zda CaM koexistuje s katalasy v peroxizómech rostlin., Organely z etiolovaných extraktů z dýňových kotyledonů byly odděleny centrifugací hustoty sacharózy. K odstranění znečištění z cytosolové proteiny, které by mohly být přítomny v roztoku nebo pouze spojené s peroxisomal membrány, izolované peroxizómech byli léčeni proteinázy K. tímto způsobem, peroxisomal bílkoviny chráněny před proteázy, které peroxisomal membrány nebyly stravitelné (34, 35). Identita peroxizomálních frakcí byla prokázána měřením katalázové aktivity (35)., CaM je velmi konzervovaná napříč královstvími (13-16), proto jsme provedli Západní analýzu s anti-lidskou vačkovou protilátkou. Jako kontrola byla použita rekombinantní bramborová vačka PCM6 (obr. 5, pruh 3). Zajímavé je, že v peroxizomálních frakcích byl přítomen pás o velikosti podobné PCM6, ale intenzita byla výrazně nižší ve srovnání s cytosolickou vačkou (obr. 5). Tyto výsledky ukazují, že CaM a kataláza jsou kolokalizovány v peroxisomech. CaM je malý kyselý protein, který je primárně exprimován v cytoplazmě., U rostlin se však ukázalo, že CaM je přítomen v několika organelách, jako je jádro a chloroplasty (36, 37) a extracelulární matrice (38). Také cam-regulované proteiny existují v extracelulární matrici, jádru a chloroplastech (38-40). Jak CaM překročí membránu, není jasné. Nedávné studie naznačují, že posttranslační modifikace hrají roli v translokaci některých vačkových isoformů. Například protein podobný petunii cam, CaM53, je spojen s plazmatickou membránou, když je protein prenylován. Pokud je prenylace inhibována, CaM53 se nachází převážně v jádru (41).,

pokud je nám známo, neexistuje žádná zpráva, která pojednává o koncentraci vápníku v peroxizómech., Na základě nedávno modifikovaného modelu peroxizomové biogeneze pochází peroxizom z endoplazmatického retikula (ER) pomocí preperoxizomálních váčků (42). Je známo, že ER je jedním z intracelulárních kalciových bazénů. Koncentrace vápníku v peroxisomech by tedy mohla být stejně vysoká jako v ER. Měření peroxisomal koncentrace vápníku a monitorování žádnou souvislost mezi změnou koncentrace vápníku v cytoplazmě a peroxisome by mělo pomoci v pochopení toho, jak peroxisomal kataláza je regulována Ca2+/CaM., Například volná koncentrace vápníku by mohla být měřena v transgenních rostlinách rekonstituovaným aequorinem se signálem zaměřeným na peroxisom. Aequorin je luminiscenční protein citlivý na vápník, jehož luminiscence přímo hlásí změnu vápníku (43). Protože peroxisome je hlavní organela, která odstraňuje toxické ROS, a to především H2O2, je rozumné spekulovat, že peroxisomal katalasy aktivita zůstává vysoká po celou dobu rozkládat H2O2 in situ rychlým tempem. Kolísání cytosolického vápníku by však mohlo mít významný vliv na aktivitu cytosolické katalázy., Je důležité zdůraznit, že ne všechny katalázy jsou proteiny vázající CaM. Proto jsou zapotřebí další vyšetřování, aby se vyřešil význam Ca2+ / CaM při kontrole katalázové aktivity v různých organelách.

Biotických a abiotických stresů vyvolat Ca2+ přílivu a zvýšení cytosolové Ca2+ stimuluje produkci H2O2, který difunduje do okolních buněk jako posel a vyvolává fyziologické reakce (19, 20). Naše výsledky naznačují, že zvýšení cytosolové Ca2+ může snížit hladiny H2O2 pomocí Ca2+/CaM-zprostředkované stimulace aktivity katalasy (Obr. 4)., Navrhujeme, aby zvýšená cytosolická Ca2 + měla dvojí roli při regulaci homeostázy H2O2 (obr. 6): (i) pozitivní regulace generuje H2O2 tím, že přímo aktivuje NADPH oxidázu, která má afinitu k Ca2+ (22) a nepřímo produkovat více NADPH pomocí Ca2+/CaM-regulované NAD kinázy (23); a (ii) negativní regulace snižuje H2O2 tím, že stimuluje kataláza činnost prostřednictvím Ca2+/CaM modulace (Obr. 4)., Signál-indukované změny v Ca2+ přechodné jevy se mohou lišit ve frekvenci, trvání, amplituda a prostorové lokalizace kmitů, a režim prostorového šíření, což vede k diferenciální účinky na vápník cílové proteiny (12, 44).