Good Mood

Indledning

Næste-generation sequencing (NGS) har hurtigt udvidet til det kliniske miljø i haemato-onkologi og onkologi, da det kan medføre store fordele for diagnose, valg af behandling, og/eller prognosticering for mange patienter (1)., For nylig flere artikler om validering af dyb målrettet NGS i klinisk onkologi blev offentliggjort (2, 3), herunder en samlet anbefaling fra Foreningen for Molekylær Patologi og College of American Pathologists (1). Manglen på standardisering af målrettede NGS-metoder begrænser dog stadig deres implementering i klinisk praksis (4).en udfordring er især den korrekte påvisning af mutationer, der er til stede ved lavvariant allelfrekvenser (VAF) og standardisering af sekventeringsdækningsdybde (1, 5, 6)., Dette er især vigtigt for mutationer, der har kliniske virkninger ved subklonale frekvenser (1), såsom tilfældet med TP53-genmutationer (TP53mut) ved kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL) (7, 8). TP53 aberrationer (TP53mut og/eller kromosom 17p sletning) er blandt de stærkeste prognostiske og prædiktive markører vejledende behandling beslutninger i CLL (9)., I dag anbefaler Det Europæiske forskningsinitiativ om kronisk lymfocytisk leukæmi (ERIC) at detektere TP53mut med en detektionsgrænse (LOD) på mindst 10% VAF (10), og der findes en voksende mængde beviser dedikeret til den kliniske virkning af små TP53-muterede underkloner i CLL (7, 8).Sanger sekventering og dyb målrettede NGS er i øjeblikket de teknikker, der mest anvendes til tp53mut analyse (10) samt til analyse af andre gener med kliniske virkninger ved lave allelfrekvenser., Selvom Sanger-sekventering giver en relativt tilgængelig sekventeringsmetode, mangler den den følsomhed, der er nødvendig for at detektere underkloner på grund af dens detektionsgrænse på 10-20% af muterede alleler (10). NGS-baseret analyse har således fået fremtrædende plads i diagnostiske laboratorier til påvisning af somatiske varianter, og forskellige tekniske udviklinger af fejlkorrektionsstrategier, både beregningsmæssige og eksperimentelle, udvikles til nøjagtig identifikation af genetiske variationer på lavt niveau (11)., Vi adresserer derfor vigtigheden af den korrekte bestemmelse af sekventeringsdybde i diagnostisk NGS for at opnå en sikker og reproducerbar detektion, ikke kun af lave VAF-varianter. Endelig udførte vi et fortyndingseksperiment for at bekræfte vores teoretiske beregninger, og vi afsluttede med at diskutere vores erfaring med diagnostisk påvisning af TP53mut hos CLL-patienter og yderligere perspektiver om NGS-standardisering inden for kræftdiagnostik.,

NGS-Sekventering Dybde og fejlprocent

NGS-sekventering dybde direkte påvirker reproducerbarhed af variant afsløring: jo højere nummer af linie sekvens læser, jo højere tillid til base opkald på en bestemt position, uanset om base ring er den samme som reference eller er muteret (1). Med andre ord, individuelle sekventering fejl læser er statistisk irrelevante, når de er undertal af korrekte læsninger., Således skal den ønskede dækningsdybde bestemmes ud fra den tilsigtede LOD, tolerancen for falske positive eller falske negative resultater og fejlfrekvensen for sekventering (1, 11).

ved Hjælp af en binomialfordeling, at sandsynligheden for falsk positive og falsk negative resultater for en given fejl sats samt beregnet LOD kan beregnes, og tærsklen for en variant, der opfordrede til en given dybde kan estimeres (1)., For eksempel, da en sekventering fejl rente på 1%, en mutant allel byrde på 10%, og en dybde af dækning 250 læser, sandsynligheden for afsløring 9 eller færre muteret læser er, ifølge den fuldstændige binomiale distribution, til 0,01%. Derfor er sandsynligheden for at detektere 10 eller flere muterede læsninger 99,99% (100-0, 01%), og tærsklen for et variantopkald kan defineres. Med andre ord vil en dækningsdybde på 250 med en tærskel på mindst 10 muterede læsninger have en 99.,99% sandsynlighed for, at 10% af den mutante allelbelastning ikke vil blive savnet af variantkaldet (selvom det kan detekteres i en anden andel). På denne måde minimeres risikoen for et falsk negativt resultat kraftigt. På den anden side afhænger sandsynligheden for falske positiver stærkt af sekventeringsfejlfrekvensen (da nøjagtigheden af alle analytiske målinger afhænger af signal-til-støj-forholdet) (1, 11). I vores eksempel er sandsynligheden for et falsk positivt resultat 0, 025%; hastigheden af falske positiver er imidlertid ikke ubetydelig, når LOD reduceres til værdien tæt på fejlfrekvensen., Konventionelle iboende NGS fejl varierer mellem 0,1% og 1% (Phred kvalitetsresultat på 20-30) (1, 11), afhængigt af sekventering platform, GC-indhold af målet regioner (12), og fragment længde, som vist i Illumina parret-end-sekventering (13). Derfor påvirkes detektion af varianter ved VAFs <2% af en høj risiko for et falsk positivt resultat uanset dækningsdybden., Det er også vigtigt at nævne, at sekventering fejlprocent gælder kun for fejl, der produceres af sekventering sig selv, og omfatter ikke andre fejl, som blev indført under DNA-behandling og i biblioteket, forberedelse, især under amplifikationstrinnene, hvilket yderligere øger fejlfrekvens (1, 11).

Minimum Sekventering Dækning i Klinisk Indstillinger

Der er i øjeblikket ingen konsensus om det nødvendige minimum dækning i en klinisk indstilling ved hjælp af dybe målrettet resequencing af NGS, og så skal det enkelte laboratorium har til at sætte sine egne parametre for at opfylde tilstrækkelig kvalitet (1, 5)., Til dato, kun få undersøgelser, der har anbefalet den minimale dækning kriterier for dybt målrettet NGS i klinisk onkologi: 500 dybde af dækning og et LOD på 5% (2), 300-500 dybde af dækning, uden at det trodser LOD (3), 250 dybde og et LOD på 5% med tærskel tilpasning til 1.000 dybde af dækning er påkrævet i tilfælde af heterogene varianter i lav tumor cellularity prøver (1), og 100 dybde med mindst 10 variant læser og et LOD på 10% (10)., I henhold til den binominale datadistribution bør en dækningsdybde på 250 faktisk være tilstrækkelig til at detektere 5% VAF med en tærskel for variantstøttelæsninger 5 5 (Figur 1). På den anden side, NGS analyse med en dækning dybde af 100 sammen med et krav om mindst 10 variant støtte lyder som anbefales af ERIC consortium (10) ville resultere i en falsk negative 45% for prøver med et LOD på 10%., For at bekræfte disse teoretiske beregninger udførte vi to uafhængige fortyndingseksperimenter for at estimere ydeevnen for TP53 NGS-analyse for at detektere 10% VAF i en dybde af dækning af 100 læsninger. Faktisk opdagede vi 30% af falske negativer (5 positive prøver af 7 ægte positive prøver og 9 positive prøver af 13 ægte positive prøver) i to uafhængige sekventeringskørsler. Desværre undervurderes den falske negative Sats ofte i målrettet rese .uencing., Også en nyere undersøgelse af inter-laboratorium resultater for somatiske variant opdagelse med VAFs mellem 15 og 50% i 111 laboratorier, der er rapporteret LODs på 5-15% (6) viser, at store fejl i diagnostisk NGS kan opstå som følge af falsk negative resultater, selv i prøver med høj mutation belastninger (6). Af tre sideløbende falske positive resultater blev alle varianter detekteret korrekt, men miskarakteriseret (6)., Da laboratorierne ikke er blevet bedt om at rapportere dækning dybde for andre regioner end de identificerede varianter (6), kan vi kun antage, at den lave dækning eller høj variant ringer tærskler bidraget til falsk negative resultater. Disse resultater yderligere fremhæve behovet for standardiserede dækning dybde parametre i diagnostiske NGS, under hensyntagen til sekventering fejl samt assay-specifikke fejl.

Frekvens af TP53 Subclonal Mutationer i CLL Fundet Gennem Diagnostiske NGS

for at vurdere forekomsten af lav af vaf i den virkelige verden indstillinger, vi revideret vores kohorte af CLL patienter undersøgt for TP53mut i vores diagnostisk laboratorium. TP53mut blev vurderet som rapporteret tidligere (14, 15). Kort fortalt blev TP53 (e .ons 2-10 inklusive 2 bp intronisk overlapning, 5′ og 3 ‘ UTR) analyseret under anvendelse af 100 ng gDNA pr., Amplicon-baserede biblioteker blev sekventeret som parret ende på mise. (2 .151, Illumina) med minimumsmål Læs dybder på 5.000.. LOD af TP53mut blev sat op til 1%, og varianterne i området 1-3% blev bekræftet ved replikation. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle de patienter, der blev indskrevet i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen, og undersøgelsen blev godkendt af det lokale etiske udvalg.

den diagnostiske kohorte af 859 CLL patienter (April 2016–April 2019), 25% (215/859) var positive for TP53mut, og af dem, 52.6% (113/215), der er varianter af vaf på 10% eller lavere., I overensstemmelse med vores observationer, en nylig undersøgelse (8) rapporterede tilstedeværelsen af 63 og 84% lav belastning (Sanger negative) TP53muts i CLL patienter, der på tidspunktet for diagnose og behandling, henholdsvis, og bekræftede, at den negative indvirkning på den samlede overlevelse af TP53muts over 1% af vaf på tidspunktet for behandling (8).,

Regnemaskine til Diagnostisk NGS Indstillinger for Registrering af Subclonal Mutationer

for At hjælpe laboratorierne med bestemmelse af minimum ordentlig dækning parametre, vi leverer en enkel, brugervenlig teoretiske lommeregner (software), der er baseret på binomialfordelingen (Figur 2), der er beskrevet i den Supplerende Fil. En applicationeb (eller desktop) applikation og stand-alone kildekoder i R er tilgængelige på Github: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Ved hjælp af denne lommeregner kan de korrekte parametre for sekventeringsdybde og det tilsvarende mindste antal varianter læses for en given sekventeringsfejlfrekvens og beregnet LOD let bestemmes. Desuden kan brugerne også tage hensyn til andre fejl ved blot at tilføje assay-specifikke fejl til sekventeringsfejlfrekvensen og bruge denne overordnede fejl som input til lommeregneren. For eksempel, i vores tilfælde af TP53 mutationsanalyse vi beregnet med den samlede fejl på ~1.16%, således vi oprettet vores minimum dækning dybde krav til 2,000 med tærskel på minimum 40 læser for 3% VAF.,

Diskussion

Selv om diagnostiske NGS har fået en fremtrædende plads i kliniske miljøer til vurdering af somatiske mutationer i det kræft, utilstrækkelig standardisering af sekventering parametre, der stadig er grænser for dens implementering i klinisk praksis (1), primært for varianter er til stede i lav-allel frekvenser (4). Vi behandlede derfor det tekniske spørgsmål om korrekt bestemmelse af sekventeringsdybden i diagnostiske NGS for at opnå sikre og reproducerbare detektioner af lave VAF-varianter., Især udførte vi teoretiske beregninger for at bestemme den optimale dækningsdybde for den ønskede Sandsynlighed for påvisning af varianter ved lave allelfrekvenser under hensyntagen til sekventeringsfejlfrekvensen. Desuden bekræftede vi disse teoretiske beregninger ved at udføre fortyndingsforsøg. Baseret på disse observationer, kan vi anbefale en dybde af dækning af 1,650 eller højere (sammen med de respektive tærskel på mindst 30 muteret læser op) for at ringe ≥3% varianter for at opnå en 99,9% sandsynlighed for, variant opdagelse, ved hjælp af den konventionelle NGS-sekventering kun ved fejl., Varianter i 1-3% VAF-området kan kun kaldes, hvis de opnåede sekvensdata er af høj kvalitet (gennemsnit3030 > 90%) og/eller når varianterne bekræftes ved replikation eller den ortogonale metode (1, 11, 16). Vi er også at give en enkel, brugervenlig teoretiske lommeregner (software) for at hjælpe laboratorierne med at løse den korrekte rækkefølge dybde og den tilsvarende minimum antal variant læser under hensyntagen til sekventering fejlprocent. Vores enkle regnemaskine kan bidrage til at minimere de falske positive og falske negative resultater i diagnostiske NGS.,

ikke desto mindre påvirkes korrekt sekventeringsdybde også af assayspecifikke faktorer (1). Fejl kan forekomme i mange faser under DNA-behandling og biblioteksforberedelse. De mest almindelige er forstærkningsfejl indført under NGS bibliotek forberedelse (1, 12, 17). Andre almindelige fejlkilder har at gøre med bibliotekets kompleksitet (antallet af uafhængige DNA-molekyler analyseret), DNA-kvalitet og målregionens kompleksitet osv. Alle potentielle assay-specifikke fejl skal løses gennem testdesign, metodevalidering og kvalitetskontrol.,

i øjeblikket udvikles nye fejlkorrektionsstrategier, både beregningsmæssige og eksperimentelle, for at afbøde de høje fejlfrekvenser i diagnostiske NGS (11). Indtil videre er blandt de mest lovende fejlkorrektionsmetoder UMI (unikke molekylære identifikatorer), som korrigerer for PCR-fejl (18), og signal-til-støjkorrektionsmetoder (11). Disse fremskridt forsøger at reducere LOD og derved øge sekventeringsnøjagtigheden, der er nødvendig for fremtidige muligheder i NGS-diagnosen.,

for at forbedre standardiseringen i diagnostisk NGS er estimeringen af korrekt dækningsdybde et anbefalet udgangspunkt ved vurdering af tærskler omkring et bestemt NGS-assay. Ikke desto mindre mangler der stadig offentliggjort vejledning vedrørende de minimale tekniske krav og dets rapportering i NGS, især vigtig i påvisning af klonale og subklonale mutationer i kræftdiagnostik., Dette skyldes hovedsageligt den brede vifte af biblioteksforberedelsesmetoder og adskillige variabler, der spiller en rolle i hvert specifikt NGS-assay, som er vanskelige at standardisere sammen med Inter-laboratory variabilitet. Derfor er definitionen af minimumstekniske krav og dens rapportering i NGS meget ønskelig., Baseret på vores erfaring i diagnosticering NGS i haemato-onkologi, foreslår vi, at rapporten mindst følgende tekniske parametre: LOD, generelle fejl af NGS-analysen (eller i det mindste sekventering fejlprocent), mængden af DNA-input, kilde, og kvaliteten af DNA, minimum dækning dybde, og den procentdel af målrettede baser sekventeret på dette minimum dybde, det samlede antal af mål, læser, der dækker variant region og antal læser støtte variant. Der bør lægges særlig vægt på NGS-standardisering af formalinfikserede paraffinindstøbte (FFPE) prøver (19, 20).,

samlet set fremhæver vores undersøgelse vigtigheden af korrekt sekventeringsdybde og det mindste antal læsninger, der kræves til pålidelig og reproducerbar påvisning af varianter med lav VAF i diagnostisk NGS. Beregningen af korrekt sekventeringsdybde for en given fejlrate ved hjælp af vores brugervenlige teoretiske lommeregner (soft .are) kan hjælpe med at minimere de falske positive og falske negative resultater i diagnostiske NGS, i situationer relateret til subklonale mutationer blandt andre., De strenge test og standardiserede minimumskrav til diagnostisk NGS er især ønskelige for at sikre korrekte resultater i kliniske omgivelser.

datatilgængelighed

de datasæt, der genereres for denne undersøgelse, er tilgængelige på rimelig anmodning til den tilsvarende forfatter.

Forfatter Bidrag

AP og EK designet undersøgelsen, fortolket resultaterne, og skrev manuskriptet. AP, LS, TD og PS udførte NGS-analyse. TP indsamlede patientprøver og kliniske data. MV udført bioinformatik analyse og skrev lommeregneren kode. TN forberedt applicationebapplikation., Alle forfattere læste og godkendte den endelige version af manuskriptet.

støtte

tilskudsstøtte: m.CR VES16-32339A, delvis af MH C.—DRO (FNOl, 00098892).

Erklæring om interessekonflikt

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

anerkendelser

Vi undskylder de mange forfattere, hvis artikler ikke kunne citeres på grund af referencegrænser.,

Supplementary Material