Good Mood

Resultater og Diskussion

Arabidopsis cDNA bibliotek blev screenet ved hjælp 35S-mærket CaM-bindende screening fremgangsmåde som beskrevet (24). En af de positive kloner viste en identisk nukleotidsekvens til Atcat3 i databasen (GenBank tiltrædelse nr. U43147). For at bevise, at AtCat3 kodede et Kambindende protein, blev den fulde kodningsområde af atcat3 subcloneret i pET14b-ekspressionsvektoren. Den rekombinante atcat3 blev induceret af isopropyl-d-d-thiogalactosid (iptg) (Fig., 1A) og blev renset ved Kamaffinitetskromatografi til næsten homogenitet. Total bakterieekstrakt blev anvendt til CaM-bindende assay, og det blev vist, at 35S-mærket CaM binder til atcat3-proteinet i nærvær af Ca2+ (fig. 1A). Efter tilsætning af EGTA blev der ikke observeret nogen CaM-binding. Endvidere binder 35S-mærket CaM ikke til atcat3, når CaCl2 blev erstattet af andre divalente kationer, såsom MgCl2 eller mncl2 (Fig. 1A), hvilket antyder, at CaM-binding til atcat3 er Ca2+ – afhængig.

for at identificere det CaM-bindende område i ATCAT3 blev to C-terminale deletionsmutanter brugt til 35S-CaM-bindende assays. I nærværelse af 0.,2 mM Ca2+, CaM binder til den vilde type og mutant 1-451, mens CaM ikke binder til mutant 1-414 (fig. 1B), hvilket antyder, at det Kambindende område for atcat3 er begrænset til aminosyrer 415-451. For yderligere at bekræfte CaM-bindingen til Atcat3 inkuberes et syntetisk peptid svarende til aminosyrerne 415-451 af Atcat3 med CaM. Dannelsen af peptid-CaM-komplekset blev vurderet ved nondenering PAGE. 36-mer peptidet er i stand til at danne et stabilt kompleks med CaM i nærvær af Ca2+ (fig. 1C). I fravær af peptid blev der observeret et enkelt CaM-bånd., Da peptidkoncentrationen steg, optrådte et andet bånd med lav mobilitet, der repræsenterer peptid-CaM-komplekset. Når molforholdet mellem peptidet og CaM var 1:1, blev kun peptid-CaM-kompleksbåndet detekteret, hvilket indikerer, at der kun er et CaM-bindingssted i peptidet. Der blev ikke dannet noget peptid-CaM-kompleks i nærvær af EGTA (Fig. 1C). Disse resultater indikerer, at CaM specifikt binder til atcat3 på en calciumafhængig måde.

katalase findes i næsten alle aerobe organismer. Hos dyr er der kun en katalase isoform kodet af et enkelt gen., I modsætning hertil er katalase i planter til stede som flere isoformer kodet af en lille genfamilie (6, 26). I det mindste gælder dette i monokoter som majs og dicoter som tobak, Arabidopsis og græskar, hvor katalase er godt karakteriseret. Interessant nok har hver af dem tre isoformer kodet af tre gener. For at afgøre, om alle katalaser har de Kambindende regioner, blev aminosyresekvenserne af 37 katalaser fra bakterier, dyr og planter sammenlignet ved hjælp af pileup-programmet i gcg10-pakken., Aminosyresekvenssammenligningen afslørede meget høj homologi i N-terminalen 384 aa (omkring 60% lighed og 50% identitet). I C-terminalen 108 aa, hvor den CaM-bindende region ligger, var der imidlertid meget lidt lighed mellem atcat3 og andre ikke-plantekatalaser (omkring 21% homologi og 14% identitet). Ikke desto mindre viste alle plantekatalaser høj homologi i denne del (omkring 78% homologi og 70% identitet), især i regionen svarende til det CaM-bindende område i atcat3. Fig. 2 viser C-terminalen 108-aa sekvenssammenligning af 13 repræsentative katalaser., Selv om den aminosyre sekvenser i karakteriseret CaM-bindende proteiner er ikke bevaret i CaM-bindende region, de fleste af dem har en sekundær strukturelle træk, de grundlæggende amphiphilic α-helix (27), som auxin-reguleret protein ZmSAUR1 (24), og planten kimære Ca2+/CaM-protein-kinase (28). Bemærk, at der ofte er negativt ladede aminosyrer i Kambindende områder, men nettoladningen er positiv (16). Baseret på den cylindriske hjul projektion ved hjælp af GCG-program, blev det besluttet, at de aminosyrer, 438-451 i AtCat3 er i stand til at danne en grundlæggende amphiphilic α-helix., Det er tydeligt, at den ene side af spiralhjulet er hydrofobt, og den anden side er hydrofil med netto positive ladninger. Analyse af aminosyresekvenserne svarende til det Kambindende område af Atcat3 forudsagde eksistensen af en grundlæggende amfifil α-Heli.i nogle af andre plantekatalaser. Interessant nok er der blandt tre katalase isoformer i majs, tobak, Arabidopsis og græskar mindst en isoform med den amfifile a-spiralformede struktur i hver art, f. eks.,, tobacco1 (aminosyrer 431-444), maize3 (aminosyrer 442-455), og pumpkin1 (aminosyrer 438-451), samt Arabidopsis AtCat1 (aminosyrer 438-451). Hvorvidt det er sandt for alle plantearter, er ikke klart på grund af de begrænsede katalasesekvenser for andre plantearter i GenBank. Baseret på krystalstrukturdataene for bakterie-og pattedyrskatalaser er a-helices de typiske strukturer i den C-terminale del af disse katalaser (29), men der findes ingen grundlæggende amfifile a-spiralformet struktur i denne del ifølge spiralformet hjulprojektion.,

for at teste, om CaM binder til renset katalase fra planta, blev tobakskatalase renset fra bladene baseret på Durner og Klessig (10). En CaM-Sepharose-søjle blev brugt som det sidste trin i rensningsprocessen. Resum .et af rensningstrinnene for katalase ved anvendelse af 1.000 g tobaksblade er vist i tabel 1. Tobakskatalase blev renset til næsten homogenitet som bedømt ved SDS/PAGE og sølvfarvning (Fig. 3, bane 1). Katalaseidentitet blev bekræftet ved Westernestern blotting med en mAb mod tobakskatalasen (Fig. 3, bane 3)., CaM-binding til renset tobakskatalase blev demonstreret ved følgende fremgangsmåder. (i) der blev anvendt en kam-Sepharosesøjle til rensning af tobakskatalase. Genfindingsgraden for dette trin var 81% (tabel 1), hvilket antyder, at det meste af katalasen fra tobaksblade er et Kambindende protein. (ii) 35S-mærket CaM blev anvendt til at teste bindingen til den rensede katalase i nærvær af 0,2 mM CaCl2 (fig. 3, bane 5). Rekombinant AtCat3 blev anvendt som kontrol (Fig. 3, baner 2, 4 og 6). Tilsætning af 0.,4 mM EGTA afskaffet Kambinding, hvilket antyder, at CaM binder til plantekatalasen på en Ca2+ – afhængig måde. Kambindende assays blev også udført for at bestemme, om det binder til svampe, kvæg eller human katalase. Resultaterne viste, at ingen af disse nonplant katalaser viste nogen CaM-binding (data ikke vist), hvilket er i overensstemmelse med aminosyresekvenssammenligningerne (fig. 2).,

det Kambindende sted eller tæt sammenstillede regioner i andre karakteriserede Kambindende proteiner fungerer ofte som autoinhibitoriske eller pseudosubstrate-domæner. Denne region opretholder målproteinerne i en inaktiv tilstand i fravær af Ca2+-signal, såsom i plantekimerisk Ca2+/CaM-afhængig proteinkinase (30) og glutamatdekarbo .ylase (31). For at undersøge betydningen af CaM-binding til plantekatalaser blev katalytiske aktiviteter af den rekombinante AtCat3 og den rensede tobakskatalase målt i nærvær og fravær af CaCl2 og CaM., Lignende eksperimenter blev også udført ved anvendelse af andre nonplant katalaser. Den E. coli-udtrykte rekombinante AtCat3 viste ingen aktivitet. Lignende resultater blev opnået i et andet laboratorium (hihi .iang Chen, personlig kommunikation). Dette kan skyldes manglende dannelse af den korrekte struktur for rekombinant katalase, fordi den aktive katalase er en tetramer bestående af fire identiske eller lignende underenheder (6, 10, 26). I modsætning hertil viste den rensede tobakskatalase en signifikant Ca2 + /CaM-afhængig ændring i aktivitet under rensningstrinnene (tabel 1)., De stimulerende virkninger af Ca2+ / CaM er omkring 2,2 gange i hvert trin, undtagen prøven, der blev opnået efter CaM-Sepharosekromatografien. Det viste en højere stimulation af katalase aktivitet (2,5-fold) muligvis på grund af fjernelse af ikke-Ca2+/CaM-bindende katalase fraktion (Tabel 1). Den ikke-Ca2+/CaM-bindende katalasefraktion havde en specifik aktivitet på 59, 6 enheder (basalaktivitet). Ca2+ / CaM stimulerede imidlertid ikke aktiviteten af denne fraktion af katalase (data ikke vist)., Disse resultater indikerer, at Ca2+ / CaM er i stand til at aktivere tobakskatalasen i den fraktion, der blev opnået efter CaM-Sepharosekromatografi, hvilket svarer til Kambindingsresultaterne. For at sammenligne virkningerne af Ca2+ / CaM på aktiviteten af katalaser fra forskellige kilder blev den relative aktivitet anvendt, fordi der er signifikant forskel i den specifikke aktivitet af katalaser fra forskellige arter. For eksempel, A. niger katalase har den specifikke aktivitet 5.7 enheder; kvæg lever katalase, 51.9 enheder; humane erythrocytter, 39.5-enheder; tobak katalase, 63.,1 enheder (i mangel af Ca2+/CaM). Fig. 4A viser, at CaCl2 alene eller CaM alene ikke havde nogen stimulerende virkning på tobakskatalaseaktiviteten (omkring 40% af maksimal aktivitet). Der blev ikke observeret nogen forskel i katalytisk aktivitet i svampe -, bovine-eller humane katalaser i nærvær eller fravær af Ca2+, CaM og Ca2+/CaM (fig. 4A). Ved at erstatte CaCl2 med MgCl2 var der ingen signifikant ændring i tobakskatalaseaktivitet i nærvær eller fravær af CaM (data ikke vist)., For yderligere at dokumentere effekten af Ca2+/CaM på anlægget katalase aktivitet, 10 µM af peptid svarende til AtCat3 CaM-bindende region (415-451) blev tilføjet til hver reaktionsblanding. Nonplant katalaser blev upåvirket af tilsætningen af peptidet. Den stimulerende virkning af Ca2+ / CaM på tobakskatalaseaktivitet blev imidlertid afskaffet ved tilsætning af peptidet (fig. 4A). Derudover afhang peptidets hæmmende virkning på tobakskatalaseaktivitet af koncentrationen af peptidet (fig. 4B)., 58%, hvilket er tæt på den basale aktivitet af katalase. Peptidet havde imidlertid ingen effekt på bovinkatalaseaktiviteten ved alle testede koncentrationer (fig. 4A). Disse resultater antyder, at Ca2+ / CaM har en stimulerende virkning på den rensede plantekatalase, men har ingen effekt på de ikke-plantekatalaser. figur 4

Calcium / CaM regulerer den katalytiske aktivitet af plantekatalase. Aktiviteten af katalase blev målt ved overvågning af H2O2 henfald ved 240 nm før og efter tilsætning af katalase i nærvær og fravær af Ca2 + og / eller CaM., Aktiviteten blev udtrykt som en procentdel af den maksimale aktivitet for hver katalase. Data er middelværdien SE SE fra fire separate eksperimenter. A) CaM aktiverer tobakskatalase ved tilstedeværelse af calcium. Peptidet svarende til det Kambindende område i Atcat3 (aminosyrer 415-451) hæmmer tobakskatalaseaktiviteten. B) kinetik af peptids hæmning af tobakskatalaseaktivitet (aminosyrer 415-451). ,, katalase af kvæglever;,, katalase af tobak.,

det vides, at katalase er et overvejende pero .isomalt en .ym, men det findes også i mitokondrier og cytoplasma (32). For eksempel er majs Cat3, som kan være en CaM-bindende katalase baseret på aminosyresekvens sammenligning, et mitokondrielt protein (33). Vores resultater (Fig. 1-4) viser, at CaM binder sig til plantekatalase og regulerer dets aktivitet. For at demonstrere tilstedeværelsen af denne regulerende aktivitet in vivo studerede vi, om CaM sameksisterer med katalase i planternes pero .isomer., Organeller fra etiolerede græskar cotyledonekstrakter blev adskilt ved saccharosetæthedscentrifugering. For at fjerne forurening af cytosolic proteiner, der kan være til stede i den løsning, eller blot i forbindelse med peroxisomal membran, de isolerede peroxisomes blev behandlet med proteinase K. På denne måde, peroxisomal proteiner, der er beskyttet mod proteinase af peroxisomal membran var ikke fordøjet (34, 35). Identiteten af de pero .isomale fraktioner blev påvist ved at måle katalaseaktiviteten (35)., CaM er meget bevaret på tværs af kongeriger (13-16), derfor foretog vi vestlig analyse med et anti-humant CaM-antistof. Som kontrol blev den rekombinante kartoffel CaM PCM6 anvendt (Fig. 5, Bane 3). Interessant nok var et bånd i en størrelse svarende til pcm6 til stede i de pero .isomale fraktioner, men intensiteten var betydeligt lavere sammenlignet med cytosolisk CaM (fig. 5). Disse resultater indikerer, at CaM og catalase er colocali .ed i Pero .isomerne. CaM er et lille surt protein, der primært udtrykkes i cytoplasmaet., I planter har CaM imidlertid vist sig at være til stede i flere organeller, såsom kernen og chloroplasterne (36, 37) og ekstracellulær Matri. (38). Der findes også CaM-regulerede proteiner i ekstracellulær Matri., kerne og chloroplaster (38-40). Hvordan CaM krydser membranen er ikke klart. Nylige undersøgelser viser, at posttranslationelle ændringer spiller en rolle i translokationen af nogle CaM isoformer. For eksempel er et petunia CaM-lignende protein, CaM53, forbundet med plasmamembran, når proteinet prenyleres. Hvis prenylering hæmmes, findes CaM53 overvejende i kernen (41).,

så vidt vi ved, er der ingen rapport, der diskuterer calciumkoncentration i Pero .isomerne., Baseret på en nylig ændret model af peroxisome biogenese, den peroxisome stammer fra endoplasmatisk reticulum (ER) ved hjælp af preperoxisomal vesikler (42). Det er kendt, at ER er en af de intracellulære calciumpuljer. Således kan calciumkoncentrationen i Pero .isomer være så høj som I ER. Måling af peroxisomal calcium koncentration og overvågning nogen sammenhæng mellem ændringen af calcium koncentration i cytoplasmaet og peroxisome skal hjælpe på vores forståelse af, hvordan peroxisomal katalase er reguleret af Ca2+/CaM., For eksempel, gratis calcium koncentration kan måles i de transgene planter med rekonstitueret aequorin med en peroxisome-målretning signal. AE .uorin er et calciumfølsomt luminescerende protein, hvis luminescens direkte rapporterer calciumændringen (43). Fordi pero .isom er en vigtig organelle, der fjerner det giftige ROS, hovedsageligt H2O2, er det rimeligt at spekulere i, at pero .isomal katalaseaktivitet forbliver høj hele tiden for at nedbryde H2O2 in situ i en hurtig hastighed. Imidlertid kan udsving i det cytosoliske calcium have en stor effekt på cytosolisk katalaseaktivitet., Det er vigtigt at understrege, at ikke alle katalaser er Kambindende proteiner. Derfor er yderligere undersøgelser nødvendige for at tackle betydningen af Ca2+/CaM i kontrol af katalaseaktivitet i forskellige organeller.

biotiske og abiotiske belastninger udløser en Ca2+ – tilstrømning, og den øgede cytosoliske Ca2+ stimulerer produktionen af H2O2, som diffunderer i omgivende celler som en messenger og inducerer den fysiologiske respons (19, 20). Vores resultater antyder, at øget cytosolisk Ca2 + kan reducere H2O2-niveauer ved hjælp af Ca2+ / CaM-medieret stimulering af katalaseaktivitet (fig. 4)., Vi foreslår, at øget cytosolisk Ca2+ har dobbelt roller i regulering af H2O2 homeostase (fig. 6): (i) en positiv regulering genererer H2O2 ved direkte at aktivere NADPH oxidase, der har affinitet til Ca2+ (22) og indirekte producerer mere NADPH ved hjælp af Ca2+/CaM-reguleret NAD-kinase (23); og (ii) en negativ regulering reducerer H2O2 ved at stimulere katalase aktivitet gennem Ca2+/CaM-modulation (Fig. 4)., Signal-inducerede ændringer i Ca2+ transienter kan variere i hyppighed, varighed, amplitude, og rumlige lokalisering af svingninger, og tilstand af rumlig udbredelse, der fører til forskellige virkninger på calcium target proteiner (12, 44).