Good Mood

resultater

ubehandlede prøver. Vi bemærker især, at selv i ufarvede prøver, forskellene mellem vand og oliedråber (Fig. 1 B og C) eller mellem forskellige bestanddele af cellen (Fig. 1D) generere tilstrækkelig kontrast til at skelne dem. I celler har højere materials-materialer såsom salte, fosfor og jern, som kan koncentreres i forskellige regioner, en tendens til at forbedre kontrasten. Fig., 1D viser en ubehandlet kinesisk hamster ovarie (CHO) celle i normalt dyrkningsmedium ved stuetemperatur. Celleoversigten og kernen med dens indre struktur er tydeligt synlige, ligesom en række mørke, sfæriske partikler i cytoplasmaet. Identifikationen af disse partikler som lipiddråber diskuteres nedenfor.

Tungmetalfarvning. Grænserne for opløsning og kontrast, når man observerer lav-materials-materialer, antyder, at væsentlige fordele kan opnås ved at farve cellerne med høj-markers-markører, såsom elektrontætte pletter eller nanopartikelguldetiketter., Faktisk er vi i stand til at detektere guldperler i vand ned til en diameter på 10 nm ved hjælp af ultratynde membraner (data ikke vist).differentiel farvning af organeller inde i celler ved anvendelse af electrondense-materialer er en standard i EM-teknik, skønt den normalt ikke anvendes til sem. Fig. 2 viser en rig variation af strukturer inde i dyrkede celler, der blev dyrket direkte på skillemembranen og derefter fikseret og farvet med uranylacetat (8). Intracellulære organeller er tydeligt synlige, herunder interne detaljer af mitokondrier (Fig. 2C), actinspændingsfibre (Fig., 2D) og komplekse rørformede og cytoskeletale strukturer (Fig. 2 A og B). Den højere stråleenergi i Fig. 2C Sonder indre struktur, hvorimod ved lavere energi(Fig . 2D) visualiseres overfladen tæt på membranen. Således kan forskellige energier bruges til at opnå tredimensionel information.

nanopartikel guld markører. Høj opløsning og specificitet af detektion kan opnås ved binding af antistoffer eller andre ligander., Som med andre EM-metoder udføres mærkning mest bekvemt ved hjælp af guld nanopartikler. I modsætning til transmission EM (TEM), som kun prøver meget tynde og ofte vilkårlige sektioner, tillader wetet sem en hurtig skift mellem det lokale og globale syn på mærkning over hele cellen. Fig. 3 A og B viser, hvordan 40-nm nanopartikel guldmærkede monoklonale antiepidermale vækstfaktorreceptorantistoffer blev brugt til mærkning af de epidermale vækstfaktorreceptorer på intakte A431 kræftceller., Fiksering er ofte nyttig og praktisk selv i våd SEM og kan lette mærkning såvel som overførsel til mikroskopet. De celler, der præsenteres her, er også farvet med uranylacetat, hvilket tillader justering af de mærkede receptorer med cellernes generelle struktur. Nanopartiklernes høje kontrast og ensartede størrelse muliggør entydig identifikation og lokalisering. At kende den nøjagtige lokalisering af enkeltreceptormolekyler åbner muligheden for at måle begivenheder såsom epidermal vækstfaktorinduceret receptordimerisering., Farvning af cellerne er ikke nødvendig til mærkning, og vi har inkluderet et billede af ufarvede, mærkede celler (Fig. 7, der offentliggøres som understøttende information på PNAS-webebstedet). Også vist er et billede, der viser, at mærkning af indre dele af cellen er mulig (fig. 8, der offentliggøres som understøttende information på PNAS-webebstedet), i dette tilfælde mærkning af mitokondrier med guldperler. Mærkning af actinfilamenter inde i cellerne er også opnået ved anvendelse af subnanometer guldpartikler efterfulgt af sølvforbedring (data ikke vist).

et eksempel på guldmærkning på bakterier er givet i Fig. 3C . Her detekteres den formodede gastrinreceptor af Helicobacter pylori (9) ved inkubation med komplekser af biotinyleret gastrin og streptavidin-coatede 20 nm guld nanopartikler. Indgivelse af det biotinylerede gastrin før det streptavidin-coatede guld gav næsten ingen fastgørelse af nanopartikler til bakterien. Dette resultat blev opnået uafhængigt af tiden mellem de to trin, hvilket antyder, at optagelsen af gastrin i H. pylori er næsten øjeblikkelig., Det faktum, at kompleksbundet gastrin ikke kom ind i cellerne, peger på muligheden for at definere grænserne for størrelsen af partikler, som kan internaliseres af bakterierne.

sammenligning af billeddannelsesteknikker (Trypanosoma brucei). Det er nyttigt at sammenligne denne teknologi med eksisterende billeddannelsesteknikker ved hjælp af et enkeltmodelsystem. En sådan undersøgelse er beskrevet i Fig. 4, ved hjælp af parasitten T. brucei procykliske form, der formerer sig i midgut af tsetse flue. De første tre billeder viser eksisterende billeddannelsesmetoder: optisk fluorescensmikroskopi (fig., 4A), differential interferens kontrastmikroskopi (fig. 4B) og TEM (Fig . 4C). Styrken af eksisterende teknikker er tydelig: lokaliseret markering i fluorescens og detaljerede sektioner i TEM. Den ubehandlede optiske (fig. 4B) og våd-SEM (Fig . 4D) billeder afgrænser cellens grænser, men er lave i kontrast og mangler detaljer. Begge understreger kernen, men andre organeller, der vises i det differentielle interferenskontrastbillede, identificeres ikke tydeligt, mens wetet-sem-billedet bringer lipiddråberne ud til en fordel. Osmiumtetroideidfarvning (Fig., 4E) er ikke så nyttigt i dette system, understreger det meste lipiddråberne og nogle uidentificerede indre organeller. Den stærkeste billeddannelse ses i Fig. 4F, for hvilken uranylacetat farvning blev anvendt. Fordelen ved intakt billeddannelse, som den fulde celle kan ses (sammen med dens fine interne strukturer, der kan observeres detaljeret), er tydelig, især i sammenligning med tem-billeddannelse (fig. 4C). Endelig er wetet-SEM-billeddannelse af helcellespecifik mærkning med antistoffer mod det store glycosylphosphatidylinositolforankrede overfladebelægningsprotein EP procyclin (10) vist i fig., 4 G og H. Interessant nok er EP procyclin kendt for at dække hele cellen ensartet, men det observerede signal er grupperet. Vi tilskriver dette tendensen hos de underliggende lipidflåder til klynge under påvirkning af antistoffer, en proces, som fiksering i formaldehyd ikke er i stand til at forhindre. Guld markører også belyse den tre-dimensionale udformning af celle på en måde, der minder om, hvilken standard, SEM kan billedet (en fremragende repræsentant SEM billede af T. brucei kan findes på http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

det er klart, at TEM generelt har bedre opløsning end wetet sem, men billederne, der præsenteres i eksemplet med T. brucei til sammenligning, er “typiske” billeder opnået i det samme laboratorium., Fordi våd SEM er anderledes end i dets nytte end TEM og optisk mikroskopi i T. brucei det kan ses som et vigtigt supplerende kapacitet, og kan man forvente at det fulde billede ville være givet ved en kombination af optiske, TEM, og våd-SEM teknik.

vævssektioner. Våd SEM kan anvendes til tykke prøver såsom vævsfragmenter ved blot at montere prøven mod membranen. Den begrænsede prøveudtagningsdybde af BSEs tillader billeddannelse af et “virtuelt afsnit”, der strækker sig fra overfladen til en defineret dybde på op til et par mikrometer uden behov for tynd sektionering.,

Fig. 5 A og B viser den direkte visualisering af ubehandlede væv fra mus. Fig. 5A er et lille forstørrelsesbillede af hjertevæv. Organiseringen af muskelcellerne er tydelig. Zoome ind på en celle (Fig. 5B) giver et levende billede af kernen og intracellulære organeller, muligvis mitokondrier, og deres spredning i cellen. Som vist ovenfor for dyrkede celler er farvning af væv fordelagtigt, men ikke bydende og kan forbedre visualiseringen af mange funktioner. Fig. 5 C og D viser et område af nyrebarken hos en rotte., Farvningen (kaliumferricyanid) fremhæver den overordnede organisation og cellekontakter inden for epitelien i nyretubuli. Omhyggelig justering af farvnings-og billeddannelsesbetingelser kan afsløre forskellige og komplementære oplysninger, såsom vævsarkitektur; f.eks. giver væv farvet med uranylacetat et klart billede af den ekstracellulære Matri. (data ikke vist).

samtidig Fotonopsamling (Cl). BSE-detektion i våd SEM kan suppleres med samtidig indsamling af fotoner., Scanningselektronstrålen e .citerer molekyler i prøven, som derefter kan udsende lys ved karakteristiske bølgelængder (CL). Lysintensiteten bruges derefter til at udlede et billede af fordelingen af funklende molekyler, enten endogene til cellen eller etiketter, der kan introduceres fremmed. Dette billede opnås samtidig med billeddannelsen ved BSE ved en opløsning, der er begrænset af elektron-stof-interaktioner og ikke ved lysdiffraktion (6). Vi indsatte en lysstyring i væsken under prøven, som leder det udsendte lys til en fotomultiplikator., Dette setup opnår god kobling og effektiv indsamling af fotonerne ophidset af elektronstrålen uden at kompromittere effektiviteten af samtidig BSE-detektion.

Fig. 6 viser ubehandlede CHO-celler, visualiseret samtidigt af BSE og fotoner. I Fig. 6A, er cellekanterne tydeligt skitseret i elektronbilledtilstanden, og kernen (sammen med dens nucleoli) er fremtrædende, ligesom de mørke ≈1-µm pletter omkring kernen. Disse forekommer i cytoplasmaet af alle eukaryote celler, vi undersøgte, og selv om deres antal varierer, spredes de normalt omkring kernen., I CL-billedet vist i Fig. 6B, celleoversigten og kernen er klart defineret, hvilket indikerer en fordeling af funklende molekyler (svarende til autofluorescens) i cellen. I denne tilstand er de samme pletter kendetegnet ved en høj emission af fotoner. Kombinationen af et højt katodoluminescerende signal og højt kulstofindhold er typisk for lipiddråber (11), som deltager i cellens energilagring (12)., En uafhængig test af tilsætning af 200 µM oliesyre forårsagede en stærk proliferation af disse dråber i cellen (data ikke vist), i overensstemmelse med forestillingen om, at de observerede pletter er lipiddråber.

våd SEM har en fordel i forhold til standard sem-teknikker til konservering af lipider, især i store aggregater, såsom lipiddråber. Eliminerer behovet for tørring sparer lipider fra organiske opløsningsmidler, der kan opløse dem. Selvom osmiumbehandling vil bevare nogle lipid-dobbeltlag, reagerer osmium i større aggregater hurtigt for at skabe en ekstern skorpe, der ikke lader osmium ind, hvilket efterlader aggregaterne sårbare over for efterfølgende organisk opløsningsmiddelbehandling., I kryogene præparater er tendensen af spaltningsprocessen til at knække langs lipid – vandgrænser også en fare for store lipidstrukturer.

højopløsningsafbildning af markører er en meget ønskelig evne til CL-detekteringsmodus, der kræver udvikling af etiketter til specifikke molekyler i celler. I Fig. 9, der offentliggøres som understøttende information på PNAS – siteebstedet, demonstrerer vi, at standard fluorescerende perler 0,2 µm i diameter udsender fotoner intenst under elektronstrålen og kan afbildes med en opløsning på 100 100 nm (7)., Billeddannelse af mindre perler er begrænset af lav lysstyrke, medfører udvikling af specialiserede scintillation perler ved lille diameter . Fordi mekanismen for excitation af scintillation er stærkest, når strålen direkte at krænke den perle, forventer vi, at dette kan forlænge beslutning af fluorescerende billeddannelse en størrelsesorden over, at ledige med optisk mikroskopi.