Es braucht eine echte Anstrengung, um Ihre Grundkenntnisse der molekularen und Zellbiologie frisch zu halten, zusätzlich zu allem anderen, was Sie tun müssen. Wäre es nicht großartig, wenn es einen Ort gäbe, an dem Sie leicht zu lesende Artikel finden könnten, mit denen Sie diese Grundlagen in nur wenigen Minuten auffrischen können?
…Ich hoffe, Sie haben „Ja“ gesagt, denn das ist das Ziel meiner“ The Basics: „- Artikelserie, die wir Ihnen bereits regelmäßig zur Verfügung gestellt haben und auch weiterhin anbieten werden. Dieser Artikel erklärt die Grundlagen der DNA-Ligation.,
Ihre DNA-Ligation Buddy: DNA-Ligase
DNA-ligase (EC 6.5.1.1) ist das Enzym im Herzen der DNA-ligation-Reaktion. Es verbindet kovalent das Phosphat-Rückgrat der DNA mit stumpfen oder kompatiblen kohäsiven Enden (siehe Abbildung 1) und seine natürliche Rolle besteht in der Reparatur von Doppelstrangbrüchen in DNA-Molekülen. In der Molekularbiologie wird es üblicherweise für die Insertion von restriktionsenzymgenerierten DNA-Fragmenten in Vektor-Backbones verwendet. Kommerzielle Ligasen werden mit einem Reaktionspuffer versorgt, der ATP und Mg2+ enthält, die beide für die Ligaseaktivität essentiell sind., Da ATP durch wiederholte Freeze-Thaw-Zyklen beschädigt werden kann, ist es ratsam, Aliquots des Puffers herzustellen (siehe meinen Artikel „5 DNA Ligation tips“).
Abbildung 1. Kohäsive und stumpfe Enden, bereit für DNA-Ligation!
Die beiden Schritte der DNA-Ligationsreaktion
Die DNA-Ligationsreaktion selbst hat zwei grundlegende Schritte. Erstens müssen die DNA-Enden zufällig kollidieren und lange genug zusammenbleiben, damit sich die Ligase ihnen anschließt. Dies ist der ineffizienteste Teil der Reaktion, ist aber bei niedrigen Temperaturen einfacher. Warum?, Nun, wie Sie wahrscheinlich wissen werden, bewegen sich alle Moleküle bei höheren Temperaturen schneller, so dass Sie sich vorstellen können, dass es für zwei DNA-Enden einfacher sein wird, zu kollidieren und zusammen zu bleiben, wenn sie bei niedriger Temperatur sanft durch die Lösung schweben, anstatt herumzupeitschen, wie es bei höheren Temperaturen der Fall wäre. Für kohäsive Enden gibt es einen zusätzlichen Grund: Niedrigere Temperaturen stabilisieren die Wasserstoffbindung zwischen den komplementären Nukleotiden, was wirklich dazu beiträgt, die Dinge an Ort und Stelle zu halten.
Abbildung 2., Die enzymatische Reaktion der DNA-ligation
Der zweite Schritt ist die enzymatische Reaktion, die schematisch in Abbildung 2.. DNA-Ligase katalysiert die Verbindung des 3′ – OH mit dem 5′ – phosphat über einen zweistufigen Mechanismus. Zunächst wird das AMP-Nukleotid, das an einen Lysin-Rückstand in der aktiven Stelle des Enzyms gebunden ist, auf das 5′ – Phosphat übertragen. Dann wird die AMP-Phosphat-Bindung vom 3′ – OH angegriffen, wobei die kovalente Bindung gebildet und AMP freigesetzt wird. Damit das Enzym weitere Reaktionen durchführen kann, muss der AMP an der aktiven Stelle des Enzyms durch ATP aufgefüllt werden.,
Aus diesem Grund können wir die DNA-Ligatur bei niedrigen Temperaturen durchführen
Das DNA-Ligase-Enzym hat eine optimale Aktivität bei 25°C, so dass die Ligationsreaktion bei einer Temperatur durchgeführt wird, die ein Kompromiss zwischen den optimalen Temperaturen für das Zusammenbringen der DNA-Enden (1°C) und der enzymatischen Reaktion (25°C) darstellt. Normalerweise ist 1hr bei 16°C in Ordnung, aber da das Zusammenbringen der DNA-Enden der am wenigsten effiziente Teil der Reaktion ist, der dies begünstigt, indem die Temperatur auf 4°C gesenkt wird, kann dies zu noch mehr Effizienz führen. Das Enzym arbeitet jedoch sehr langsam bei dieser Temperatur, so dass eine lange (z., über nacht) Inkubationszeit erforderlich ist.
Ursprünglich veröffentlicht am 31. Oktober 2007; aktualisiert und veröffentlicht am 5. Dezember 2014.
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