Objetivos
- familiarizarse con la especiación del género Staphylococcus.
- crecer e identificar diferentes especies de estafilococos utilizando agar selectivo y diferencial
- identificar los 3 tipos hemolíticos en agar sanguíneo.,
Staphylococcus es un género de Gram+, Cocos no formadores de esporas que pertenecen a la familia Micrococcaceae que a menudo se encuentran como microbiota humana normal de la piel y la cavidad nasal. Hay cinco organismos a considerar como patógenos humanos potenciales en este género: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophiticus, S. haemolyticus y S. hominis, pero los tres primeros son los aislados más comunes. S. aureus es a menudo considerado como el más problemático de los tres patógenos y se distingue de los otros dos por ser el único capaz de coagular el plasma. S., aureusis capaz de causar muchas infecciones piogénicas superficiales (formadoras de pus) de la dermis y los tejidos subyacentes, así como infecciones sistémicas graves. Puede producir una variedad de toxinas, incluyendo enterotoxinas (intoxicación alimentaria), citotoxinas (toxinas sistémicas generales) y superantígenos de choque tóxico. Los otros estafilococos coagulasa negativos (S. epidermidis y S. saprophiticus) se encuentran con mucha menos frecuencia como patógenos, pero ocasionalmente se asocian con endocarditis,infecciones de articulaciones protésicas e infecciones de heridas, solo por nombrar algunos.,
Este ejercicio le da la oportunidad de utilizar medios selectivos, en este caso basados en cloruro de sodio alto (MSA y SM1 10 son ambos medios selectivos para el aislamiento de estafilococos – NaCl al 7,5%). Un medio selectivo tiene un agente inhibitorio que favorece el crecimiento de ciertas bacterias al inhibir otras. MSA contiene un indicador adicional para el monitoreo de la fermentación del manitol, lo que lo convierte en un medio diferencial también., De las bacterias que pueden crecer en presencia de alto NaCl, algunas son halofílicas (que requieren una cierta concentración de sal para crecer) mientras que otras son halodúricas (no use la sal, pero puede tolerarla). Staphylococcusis no halofílico, sino más bien halodúrico, en que puede vivir o soportar altas concentraciones de NaCl. El alto contenido de sal en SM1 10 y MSA inhibe otros microorganismos comunes de la piel. Los otros medios que se utilizan en este ejercicio son para diferenciar Staphylococcus patógeno de no patogénico, y para la identificación de la especie.,
no solo resistente a la sal, Staphylococcus siempre es facultativamente anaeróbico. Cuando se tiñe, se verá en grupos pequeños ( estafilococo = grupo). El estafilococo generalmente es beta hemolítico o no hemolítico en absoluto (llamado hemólisis gamma). Los estafilococos patógenos pueden producir una variedad de factores de virulencia, incluyendo toxinas,coagulasa, leucocidinas y enzimas hidrolíticas que pueden dañar los tejidos del huésped.
El agar de sangre (BAP) se elabora con un 5% de sangre de oveja. Es un medio común utilizado para cultivar bacterias porque:
- Es un gran medio de enriquecimiento para bacterias exigentes.,
- La hemólisis de las células sanguíneas puede ser muy útil como prueba de identificación.
El agar CNA es un tipo de agar sanguíneo. La única diferencia es que la CNA tiene un antibiótico, ácido naladixico, que inhibe las bacterias gram.
es la descomposición de los glóbulos rojos. Las hemolisinas son enzimas producidas por algunas bacterias y se liberan en el medio alrededor de la colonia bacteriana. Puede ser una descomposición completa de las células, con la liberación de hemoglobina y una eliminación del rojo del medio circundante alrededor de la colonia., O la hemólisis puede ser una ruptura parcial, lo que resulta en una zona verdosa o verde-amarilla alrededor de la colonia.,i>
esquema del procedimiento de identificación
1ª sesión DNasa coagulasa ejecutar otras pruebas necesarias identificar especies
MSA sm110 onpg
catalasa oxidasa
gram fenol rojo lactosa
caldo de tinción
los procedimientos
nota
asegúrese de mantener una lista de todos los resultados de las pruebas de sus aislamientos.,
1a sesión
- a cada mesa se le dará una especie estafilocócica que crece en placa aNA o TSA.
- usando una técnica de raya de aislamiento, inocule el ácido naladixico de Columbia (CNA) y coloque el disco de novobiocina en la Sección 1.
- La sensibilidad a la novobiocina es una característica diferenciadora clave entre algunas de las especies de estafilococos. Coloque fórceps en el alcohol y luego esterilice los fórceps pasándolos rápidamente por la llama. El alcohol se incendiará y cuando se evapore de las pinzas, entonces serán estériles., Ahora puede elegir un disco de novobiocina del soporte para colocarlo en la placa de CNA, en la primera sección de la raya (donde habrá un crecimiento confluente de la bacteria).
- para las otras placas de agar SM placa SM 110, placa de manitol sal agar (MSA), placa de Agar DNasa—una línea de inoculación en el Centro de la placa es adecuada para los resultados de crecimiento.
- incubar medios a 37 ° C.
- Realizar pruebas de oxidasa y catalasa en cultivo de placas.
- Gram mancha el aislado para obtener forma y disposición, así como la reacción gram.
- haremos la prueba ONPG la próxima sesión., Esa prueba requiere la activación de un conjunto de genes, el operón lac. Para inducir esta actividad, la bacteria tiene que estar expuesta a la lactosa. Es por eso que también inoculará un tubo de caldo de lactosa rojo fenol.
2a sesión
- vaya a los ejercicios de laboratorio individuales para interpretar la prueba de sal de manitol y DNasa (requiere HCl).
- en la placa de CNA, usted está comprobando para 2 reacciones – – – sensibilidad al antibiótico de novobiocina y hemólisis de la sangre.,
- sensibilidad a novobiocina – una zona de 17 mm indica sensibilidad
- reacciones hemolíticas :
- hemólisis Alfa (α)–zona verde alrededor de la colonia, causada por una fuga de hemoglobina convertida en biliverdina, llamada hemólisis parcial
- hemólisis beta (β)–limpieza completa alrededor de la colonia causada por descomposición de los glóbulos rojos por enzimas estreptolisinas
- hemólisis gamma (γ) – Sin hemolisinas, sin zona
- Las especies de estafilococos son beta hemolíticas o gamma (no hemolíticas)., Staph aureus produce la toxina alfa que típicamente causa amplias zonas de hemólisis beta (completa).
- Verificación de la SM 110 para el crecimiento y para el pigmento. Los nutrientes y vitaminas en este medio mejoran la pigmentación del estafilococo patógeno, convirtiéndose esas colonias en una colonia de naranja amarillenta.
- ejecutar la prueba de la coagulasa: hay un ejercicio vinculado para esta prueba. Solo hay unas pocas especies de estafilococos que son positivos para la prueba de la coagulasa (ver tabla a continuación), y S. aureus es el más común., Dado que hay 2 tipos de coagulasa enzimática unida y libre – – – hay 2 pruebas diferentes que se pueden utilizar para identificar estas enzimas. El método del tubo es la prueba definitiva del 2, el más confiable. El ejercicio de prueba de coagulasa en el manual de laboratorio describe claramente estas 2 versiones.
- Se ejecutará la prueba ONPG. Busque en los ejercicios de laboratorio para esta prueba las instrucciones sobre cómo realizar la prueba. Dado que hay muy poco líquido en el tubo, usted querrá cubrir la parte superior del tubo parafilm y luego colocar la parte superior del tubo sobre eso. Esto reduce la deshidratación.,
3rd Session
- La reacción de prueba principal para usar en la identificación de estafilococos es la reacción de prueba de coagulasa, que divide el género Staphylococcus en 2 grupos: especies coagulasa negativas y especies coagulasa positivas. El medio de prueba que ejecutará para la identificación depende de la categoría en la que se encuentre su organismo. Es posible que desee realizar algunas de las siguientes pruebas.,
- Available media:
- arginine and ornithine
- decarboxylase broths
- urea broth
- ONPG
- sucrose, trehalose, maltose sugars
- VP broth
- nitrate broth
- If you have a coagulase positive Staph, there are only a few species available as your choice: there is a table with those species below.,
- Si su organismo es coagulasa negativa, consulte el diagrama de flujo a continuación, así como el manual de Bergey u otros libros de identificación.
- Ejecutar las pruebas necesarias para la identificación. DEPENDE DE USTED DETERMINAR QUÉ PRUEBAS ADICIONALES EJECUTAR PARA UNA IDENTIFICACIÓN CLARA.
4a sesión
- lea las pruebas de la última sesión (consulte los ejercicios de laboratorio para obtener información sobre las interpretaciones de las pruebas.
- escriba un informe para su IDENTIFICACIÓN de especies de estafilococos, si su instructor le indica que lo haga.,
| Tube coagulase | Acid from trehalose | VP test | ONPG test | |
| S. aureus | + | + | + | – |
| S. intermedius | + | + | – | + |
| S., hyicus | variable | + | – | – |
| S. schleiferi | + | – | + | ? |
Common coagulase negative Staphylococcal species
| S. aureus | S. epidermidis | S. saprophiticus | |
| Alpha toxin (ß-hemolysis) | + (most strains) | – | – |
| Growth on 7.,acace93570″>DNase production | + (usually) | – | – |
| Sensitivity to novobiocin | sensitive | sensitive | resistant |
* Novobiocin sensitivity = >17mm zone size
QUESTIONS
- Which type of hemolysis is often associated with pathogenicity?,
- ¿cuáles son las características distintivas del género Staphylococcus?
- ¿Puede dar la reacción de prueba de S. aureus para cada una de las pruebas principales ejecutadas—MSA, SM110, coagulasa, catalasa, oxidasa y DNasa?
- ¿Qué sucede con los glóbulos rojos en la hemólisis beta y alfa?
los Contribuyentes y Atribuciones
-
Jackie Reynolds, Profesor de Biología (Richland College)
