descubrimiento del ADN mitocondrial
algunos conceptos toman el mundo científico por asalto, pero otros lo conquistan solo después de muchas escaramuzas. El descubrimiento del ADN mitocondrial (ADNmt) pertenece a esta segunda categoría. Bioquímicos, histólogos y microscopistas electrónicos habían visto ADN en las mitocondrias durante años, pero la mayoría de ellos no estaban listos para la idea de que el ADN realmente pertenecía allí. Esto puede explicar por qué los libros de texto del ADNmt casi nunca dicen cómo se descubrió este ADN.,
después de que el plan básico de construcción de la célula eucariota hubiera sido revelado a principios de la década de 1950 por las micrografías electrónicas de Palade, Sjöstrand y otros, los bioquímicos abrazaron el dogma de de Duve de que cada macromolécula tenía una, y solo una, ubicación intracelular. En el análisis de fracciones celulares, se tomó el citocromo oxidasa como marcador para las mitocondrias, el fosfato dinucleótido de nicotianamida adenina (NADPH) – citocromo C reductasa para el retículo endoplásmico y el ADN para el núcleo., Dado este estado de ánimo, es fácil entender por qué la presencia de ADN en las fracciones mitocondriales se atribuyó generalmente a la contaminación por fragmentos nucleares. Las manchas histoquímicas de ADN, como la reacción de Feulgen, también tiñeron los cinetoplastos de los tripanosomas y el’ Nebenkern ‘ de los espermatozoides de insectos, pero en ese momento aún no se reconocía que estas estructuras eran, de hecho, mitocondrias inusuales., También se detectaron cantidades masivas de ADN extranuclear en el citoplasma de ovocitos de anfibios, pero tomó muchos años darse cuenta de que este ADN era, de hecho, ADNmt cuya abundancia reflejaba la enorme cantidad de mitocondrias en estas células grandes. En 1961, en La Quinta Reunión Anual de la Sociedad Americana de Biología Celular en Chicago, Hans Ris mostró micrografías electrónicas de mitocondrias con inclusiones similares a los nucleoides que contienen ADN de las bacterias e hizo la propuesta herética de que las mitocondrias (y también los cloroplastos) contienen su propio ADN., En un artículo que apareció al año siguiente, RIS y Walter s Plaut documentaron y ampliaron estas observaciones. Poco después, la evidencia bioquímica y morfológica de varios grupos confirmó la presencia de ADN en cloroplastos.
el descubrimiento del ADN de cloroplastos hizo que los bioquímicos echaran un nuevo vistazo a los primeros hallazgos de Margaret Mitchell y Boris Ephrussi de que ciertas mutaciones que afectan la función mitocondrial en el molde Neurospora crassa y la levadura Saccharomyces cerevisiae no se heredaron de acuerdo con las leyes de Mendel., Parecía tentador especular que los desconocidos «factores extracromosómicos» implicados en estas mutaciones eran, de hecho, el ADNmt.
en 1962, el fundamento del concepto de ADNmt estaba bien preparado, pero el concepto en sí no era generalmente aceptado. En retrospectiva, parece que la comunidad científica estaba esperando estudios convincentes que documentaran la existencia del ADNmt por varios métodos diversos.
uno de estos estudios vino de los microscopistas electrónicos Margit MK Nass y Sylvan Nass, que entonces trabajaban en el Instituto Wenner Gren de la Universidad de Estocolmo., Mostraron que la matriz de las mitocondrias de embrión de pollito fijo por osmio contenía inclusiones en forma de hilo cuya apariencia después de diferentes procedimientos de fijación era muy similar a la del nucleoide de ADN libre de histonas de bacterias: después de la fijación con tetroxuro de osmio, las inclusiones parecían agrupadas y como barras con un diámetro de ~400 Å; la fijación de los tejidos con tetroxuro de osmio seguida de un tratamiento con acetato de uranilo antes de que la deshidratación los hiciera aparecer como fibras delgadas de 15-30 Å., Evidencia aún más convincente de la presencia de ADN en estas inclusiones fue la observación de que las inclusiones podrían eliminarse tratando el tejido embrionario ligeramente fijo Con DNasa. El tratamiento con pepsina, con RNasa o con controles tampón libres de DNasa fue ineficaz. La claridad de estas micrografías electrónicas y los controles cuidadosos que se incluyeron tuvieron un impacto convincente en los biólogos celulares. MMK Nass y S Nass publicaron su trabajo en dos artículos consecutivos en una edición de 1963 del Journal of Cell Biology., En ese momento, sin embargo, la biología celular y la bioquímica todavía eran disciplinas bastante diferentes y la mayoría de los bioquímicos no revisaban las revistas dedicadas a la biología celular. Por lo tanto, tomó un tiempo antes de que los hallazgos de MMK Nass y S Nass entraran en la conciencia de la comunidad bioquímica.
aproximadamente al mismo tiempo, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy y Schatz en el Instituto de Bioquímica de la Universidad de Viena estaban tratando de encontrar una base bioquímica para las mutaciones extracromosómicas que abolieron la función respiratoria en la levadura S. cerevisiae., A principios de la década de 1960, muchos bioquímicos todavía eran reacios a considerar los «gránulos respiratorios» de la levadura como mitocondrias de buena fe, lo que colocó la investigación de Haslbrunner et al. bien fuera de la corriente principal de la bioquímica mitocondrial en los Estados Unidos y en otros lugares.
para buscar ADN en las mitocondrias, se optó por un enfoque bioquímico. Las mitocondrias de levadura se purificaron con los mejores métodos disponibles, y su contenido de ADN se midió mediante la reacción de color «Diesche» de larga data., Unos años antes, de Duve y sus colaboradores habían demostrado que la centrifugación de fracciones subcelulares en equilibrio en un gradiente de densidad a menudo daba una separación limpia de diferentes orgánulos. Sorprendentemente, los gradientes usuales de sacarosa no separaron las mitocondrias de levadura de los fragmentos nucleares, pero cuando la sacarosa fue reemplazada por el agente de contraste de rayos X ‘Urografin’, las mitocondrias formaron una banda extremadamente afilada, y el ADN estaba presente en solo dos fracciones: la mayoría estaba en la parte inferior del tubo de centrífuga, y una cantidad muy pequeña, pero el pico discreto coincidió exactamente con el de las mitocondrias., El ADN en la fracción inferior fue fácilmente digerido por la DNasa y aparentemente representaba ADN nuclear. El ADN en la fracción mitocondrial no fue fácilmente digerido por la DNasa a menos que los orgánulos se interrumpieron primero con ácido tricloroacético; presumiblemente, representaba el ADN encerrado por las membranas mitocondriales. Su concentración fue muy constante entre diferentes experimentos−entre 1 y 4 µg mg-1 proteína mitocondrial. La urografina-mitocondrias purificadas de hígado de rata, riñón de rata y corazón bovino-contenía casi 10 veces menos ADN, entre 0.2 y 0.6 µg de ADN por mg de proteína., Se calculó que la mitocondria típica de los mamíferos contenía 3 × 10-17 g de ADN. Suponiendo que el ADN fuera de doble cadena, no podría codificar más de 1,2 MDa de cadenas polipeptídicas. Este resultado fue considerado importante, porque excluía firmemente la posibilidad de que el ADNmt codificara todas las proteínas mitocondriales. Hoy en día, este cálculo temprano de Haslbrunner et al. podría ser desafiado por varios motivos, sin embargo, se acercó notablemente a la realidad: los 13 polipéptidos codificados por el ADNmt de los mamíferos tienen una masa total de 0.,423 MDa, y el resto del potencial de codificación se explica en gran medida por los genes de los ARN ribosómicos y de transferencia, así como por el hecho de que las mitocondrias suelen tener más de una copia de su genoma de ADN.
