diagnóstico de laboratorio de hemoglobinopatías
la investigación primaria de una hemoglobinopatía debe incluir un hemograma completo, una película de sangre periférica y electroforesis de hemoglobina (ver Fig. 29.4). El hemograma completo permite evaluar la formación de hemoglobina, juzgada por los índices de glóbulos rojos, el volumen celular medio (MCV) y la hemoglobina celular Media (MCH)., Microcitosis (MCV < 76 fL) e hipocromia (MCH < 27 pg), frente a un recuento de glóbulos rojos normal o elevado (> 5.5 × 1012/L) en un paciente repleto de hierro, sugiera un diagnóstico de talasemia. En el caso de la β talasemia mayor o intermedia, esto se asocia con un grado significativo de anemia, mientras que en el rasgo talasemia la hemoglobina suele ser normal o sólo ligeramente reducida. El examen de una película de sangre teñida por un método de Giemsa puede ser útil para confirmar el diagnóstico., Sin embargo, el diagnóstico definitivo a menudo se basa en el análisis electroforético o cromatográfico de la hemoglobina en hemolisados de glóbulos rojos. La electroforesis de acetato de celulosa a pH alcalino (8.9–9.1) es el método más utilizado, siendo simple, rápido, económico y eficaz en la separación de las variantes comunes de hemoglobina. En la anemia falciforme homocigótica predomina el HbS. Una cantidad variable de HbF está presente, proporciones más altas (> 10%) generalmente se asocian con un curso clínico más leve. La concentración de hemoglobina A2 es normalmente normal.,
la prueba de solubilidad basada en la solubilidad reducida de desoxi-HbS en presencia de agentes reductores, por ejemplo, ditionito de sodio, tiene un papel limitado en el diagnóstico de la enfermedad de células falciformes, ya que no diferencia la enfermedad homocigótica y los Estados portadores. En una situación de emergencia, una prueba de solubilidad positiva tomada junto con una hemoglobina significativamente reducida y una morfología típica de los glóbulos rojos apunta fuertemente hacia un diagnóstico de anemia de células falciformes. Esto deberá confirmarse mediante un análisis de hemoglobina lo antes posible., Otras variantes, como el HBD, el HBG y el HB Lepore, tienen una movilidad electroforética idéntica a la del HBS en acetato de celulosa, pero pueden distinguirse por la prueba de solubilidad falciforme negativa y la electroforesis en gel de agar citrato a pH ácido (6,0). Del mismo modo, las hemoglobinas C, E y O, que co-migran en acetato de celulosa a pH alcalino, se pueden diferenciar por electroforesis de agar citrato. Tanto HBE como HB Lepore están asociados con índices de glóbulos rojos talasémicos, lo que ayuda aún más a su distinción de variantes electroforéticamente similares., El enfoque isoeléctrico mejora la resolución de algunas variantes estructurales y también se puede utilizar para el cribado neonatal de los eluidos de las tarjetas Guthrie (mancha de sangre seca), ya que reduce la interferencia de la metahemoglobina presente en dichas muestras.
la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un método rápido y sensible para la separación y cuantificación de hemoglobinas que, en algunos casos, permite la identificación de variantes No posibles por otras técnicas., Dado que está automatizado en gran medida y requiere cantidades mínimas de muestra, la HPLC se ha convertido en el método de elección para las pruebas de población a gran escala, como los programas de detección neonatal. En los Estados Unidos y en Inglaterra se ha venido utilizando desde hace algún tiempo el cribado neonatal universal para la anemia drepanocítica, y se están introduciendo programas similares en otros países de Europa, Oriente Medio y África, en función de la prevalencia de las enfermedades y de los recursos disponibles., Esos programas han dado lugar a importantes beneficios en términos de reducción de la mortalidad y la morbilidad gracias a la mejora de la atención, la aplicación temprana de la profilaxis contra la infección neumocócica y la educación de los padres. En la β talasemia, la proporción de hemoglobinas individuales varía según el genotipo subyacente. La talasemia β0 homocigótica se asocia con un predominio de HbF, ausencia de HbA y cantidades variables de HbA2 (rango 1,0–6,0%, Media 1,7%). En individuos con talasemia β + homocigótica o talasemia β0/β + heterocigótica compuesta, una cantidad variable de HbA está presente., La hemoglobina F Aumenta y se distribuye de forma heterogénea entre los glóbulos rojos.
la cuantificación precisa de HbA2 por HPLC o cromatografía de microcolumna es esencial para el diagnóstico del rasgo β talasemia, en el que la HbA2 está elevada, típicamente > 3,5%., Los portadores de talasemia β «normal A2» o «silenciosa» debida a defectos leves del gen β o a la co-herencia de una mutación del gen δ en cis o trans no pueden distinguirse fácilmente de la talasemia α mediante métodos de cribado convencionales y requieren investigación mediante técnicas especializadas, incluida la síntesis in vitro de la cadena de globina y el análisis del ADN. El análisis de las relaciones sintéticas de la cadena de globina por incorporación de leucina tritiada y cromatografía de carboximetilcelulosa es la forma definitiva de identificar individuos con talasemia, aunque rara vez se utiliza debido a su naturaleza laboriosa.,
Las talasemias α se caracterizan electroforéticamente por la presencia de variantes de movimiento rápido, HB Bart (γ4) y HbH (β4), que son más obvias en muestras neonatales. En hidropesía fetal debido a la talasemia α0 homocigótica, predomina la HB Bart y se encuentra en cantidades más pequeñas en otros síndromes α talasémicos en el período neonatal. La hemoglobina H también se puede detectar mediante tinción para los cuerpos de inclusión de HbH., El diagnóstico de formas clínicamente silenciosas de α talasemia es a menudo de exclusión, que se realiza sobre la base del origen étnico del sujeto, los índices microcíticos hipocrómicos de glóbulos rojos y una concentración normal o baja de HbA2 en presencia de un estado de hierro normal. El diagnóstico definitivo se puede hacer mediante análisis de ADN, que también puede distinguir a menudo α0 y α + talasemia.,
mientras que la mayoría de las hemoglobinopatías pueden diagnosticarse mediante electroforesis de hemoglobina, las variantes causadas por sustituciones de aminoácidos que no alteran la carga, como las que se encuentran en algunas hemoglobinas inestables o hemoglobinas con afinidad alterada al oxígeno, pueden escapar a la detección. Otras investigaciones que pueden ser útiles en este contexto incluyen la evaluación de la inestabilidad de la hemoglobina y la afinidad por el oxígeno., El análisis de ADN de alto rendimiento ha hecho de esto una forma viable de detección de mutaciones de globina en los países más ricos, con técnicas como la amplificación de sondas dependientes de ligadura múltiple que permiten la identificación de grandes mutaciones genéticas que anteriormente solo eran detectables utilizando el Southern blotting. La espectrometría de masas de hemoglobina también se puede utilizar para identificar globinas anormales midiendo su masa con precisión, con un uso potencial particular en programas de detección que ya utilizan espectrometría de masas.,
la identificación de parejas en riesgo de hemoglobinopatías mayores mediante cribado prenatal o preconcepcional permite una elección reproductiva informada con la opción de diagnóstico prenatal. En la mayoría de los casos, esto ahora se puede lograr en el primer trimestre mediante la detección de genes globina mutantes en el ADN velloso coriónico. En varios países, especialmente Chipre, donde la tasa de portadores de β talasemia alcanza el 12%, Esto ha llevado a un marcado descenso en la incidencia de trastornos de hemoglobina al nacer., El diagnóstico genético preimplantacional se utiliza cada vez más para permitir la selección de embriones no afectados, aunque sigue siendo un proceso exigente y costoso que no es aplicable a la mayoría de las parejas. Se sigue intentando desarrollar un diagnóstico prenatal no invasivo utilizando células fetales y ADN en sangre materna, aunque actualmente no es técnicamente factible como procedimiento de rutina para las hemoglobinopatías.
