Good Mood

resultados y discusión

La Biblioteca de arnc de Arabidopsis se examinó utilizando el enfoque de selección de unión CaM marcado con 35S, como se describe (24). Uno de los clones positivos mostró una secuencia de nucleótidos idéntica a AtCat3 en la base de datos (GenBank accession no. U43147). Para probar que AtCat3 codificó una proteína de unión CaM, la región de codificación completa de AtCat3 fue subclonada en el vector de expresión pET14b. El atcat3 recombinante fue inducido por isopropil β-D-tiogalactósido (IPTG) (Fig., 1A) y fue purificado por cromatografía de afinidad CaM hasta casi la homogeneidad. Se utilizó extracto bacteriano Total para el ensayo de unión de CaM, y se demostró que la CaM marcada con 35S se une a la proteína AtCat3 en presencia de Ca2+ (Fig. 1A). Después de agregar EGTA, no se observó Unión CaM. Además, la CaM etiquetada con 35S no se unió a AtCat3 cuando CaCl2 fue reemplazado por otros cationes divalentes como MgCl2 o MnCl2 (Fig. 1A), sugiriendo que la Unión de CaM a AtCat3 es dependiente de Ca2+.

para identificar el área de unión CaM en AtCat3, se utilizaron dos mutantes de deleción C-terminal para los ensayos de unión CaM 35S. En presencia de 0.,2 mM Ca2+, CaM se une al tipo salvaje y al mutante 1-451, mientras que CaM no se une al mutante 1-414 (Fig. 1B), sugiriendo que la región de unión CaM para AtCat3 está restringida a los aminoácidos 415-451. Para confirmar aún más la Unión de CaM A AtCat3, se incubó un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 415-451 de AtCat3 con CaM. La formación del complejo peptídico-CaM se evaluó mediante PAGE No desaturante. El péptido 36-mer es capaz de formar un complejo estable con CaM en presencia de Ca2+ (Fig. 1C). En ausencia de péptido, se observó una sola banda CaM., A medida que la concentración peptídica aumentaba, apareció otra banda con baja movilidad, representando el complejo peptídico-CaM. Cuando la relación molar entre el péptido y la CaM fue de 1:1, solo se detectó la banda compleja péptido-CaM, lo que indica que solo hay un sitio de unión de CaM en el péptido. No se formó ningún complejo peptídico-CaM en presencia de EGTA (Fig. 1C). Estos resultados indican que la CaM se une específicamente al AtCat3 de una manera dependiente del calcio.

la catalasa existe en casi todos los organismos aeróbicos. En los animales, solo hay una isoforma de catalasa codificada por un solo gen., En contraste, la catalasa en las plantas está presente como múltiples isoformas codificadas por una pequeña familia de genes (6, 26). Al menos esto es cierto en monocotiledóneas como el maíz y dicotiledóneas como el tabaco, Arabidopsis y calabaza, en las que la catalasa está bien caracterizada. Curiosamente, cada uno de ellos tiene tres isoformas codificadas por tres genes. Para determinar si todas las catalasas tienen las regiones de unión CaM, se compararon las secuencias de aminoácidos de 37 catalasas de bacterias, animales y plantas utilizando el programa de acumulación en el paquete GCG10., La comparación de la secuencia de aminoácidos reveló una homología muy alta en el N-terminal 384 aa (aproximadamente 60% de similitud y 50% de identidad). Sin embargo, en la C-terminal 108 aa, donde se encuentra la región de unión CaM, hubo muy poca similitud entre AtCat3 y otras catalasas no vegetales (aproximadamente 21% de homología y 14% de identidad). Sin embargo, todas las catalasas vegetales mostraron una alta homología en esta porción (aproximadamente 78% de homología y 70% de identidad), particularmente en la región correspondiente al área de unión de levas en AtCat3. Higo. 2 muestra la comparación de secuencias C – terminal 108-aa de 13 catalasas representativas., Aunque las secuencias de aminoácidos en las proteínas caracterizadas de unión a CaM no se conservan en la región de unión a CaM, la mayoría de ellas tienen una característica estructural secundaria, La α-hélice anfifílica básica (27), como la proteína regulada por auxina ZmSAUR1 (24) y la proteína quinasa quimérica Ca2+/CaM de la planta (28). Tenga en cuenta que a menudo hay aminoácidos cargados negativamente en las regiones de unión a CaM, pero la carga neta es positiva (16). Sobre la base de la proyección de la rueda helicoidal utilizando el programa GCG, se determinó que los aminoácidos 438-451 en AtCat3 son capaces de formar una α-hélice anfifílica básica., Está claro que un lado de la rueda helicoidal es hidrofóbico y el otro lado es hidrofílico con cargas netas positivas. El análisis de las secuencias de aminoácidos correspondientes a la región de unión CaM de AtCat3 predijo la existencia de una α-hélice anfifílica básica en algunas de otras catalasas de plantas. Curiosamente, entre tres isoformas de catalasa en maíz, tabaco, Arabidopsis y calabaza, hay al menos una isoforma con la estructura anfifílica α-helicoidal en cada especie, e. g.,, tobacco1 (aminoácidos 431-444), maize3 (aminoácidos 442-455), y pumpkin1 (aminoácidos 438-451), así como Arabidopsis AtCat1 (aminoácidos 438-451). Si esto es cierto para todas las especies de plantas no está claro debido a las secuencias de catalasas limitadas para otras especies de plantas en GenBank. Según los datos de la estructura cristalina de las catalasas bacterianas y de mamíferos, las hélices α son las estructuras típicas en la porción C-terminal de estas catalasas (29), pero no existe una estructura α-helicoidal anfifílica básica en esta porción de acuerdo con la proyección de la rueda helicoidal.,

para probar si la CaM se une a la catalasa purificada de planta, la catalasa de tabaco se purificó de las hojas a base de Durner y Klessig (10). Se utilizó una columna de leva-Sefarosa como último paso en el proceso de purificación. El resumen de las etapas de purificación de la catalasa utilizando 1.000 g de hojas de tabaco se presenta en la tabla 1. La catalasa de tabaco fue purificada hasta casi la homogeneidad juzgada por SDS / PAGE y tinción de plata (Fig. 3, carril 1). La identidad de la catalasa fue confirmada por Western blotting con un mAb contra la catalasa del tabaco (Fig. 3, carril 3)., La Unión de la CaM a la catalasa de tabaco purificada se demostró mediante los siguientes enfoques. i) se utilizó una columna de CaM-Sefarosa para la purificación de la catalasa de tabaco. La tasa de recuperación para este paso fue del 81% (Tabla 1), lo que sugiere que la mayor parte de la catalasa de las hojas de tabaco es una proteína de unión a CaM. (ii) se utilizó CaM etiquetada con 35S para probar la unión a la catalasa purificada en presencia de CaCl2 de 0,2 mM (Fig. 3, Carril 5). Se utilizó AtCat3 recombinante como control (Fig. 3, carriles 2, 4 y 6). Suma de 0.,4 mm EGTA abolió la Unión CaM, lo que sugiere que la CaM se une a la catalasa de la planta de una manera dependiente de Ca2+. Los ensayos de unión de CaM también se llevaron a cabo para determinar si se une a la catalasa fúngica, bovina o Humana. Los resultados revelaron que ninguna de estas catalasas no vegetales mostró Unión alguna a CaM (datos no mostrados), lo que está de acuerdo con las comparaciones de secuencias de aminoácidos (Fig. 2).,

El CaM-sitio de unión o estrechamente yuxtapuestos regiones en otras caracteriza CaM-proteínas de unión a menudo funcionan como la autoinhibición o pseudosustrato dominios. Esta región mantiene las proteínas diana en un estado inactivo en ausencia de señal de Ca2+, como en la proteína quinasa dependiente de Ca2+/CaM quimérica vegetal (30) y la glutamato descarboxilasa (31). Para estudiar la importancia de la Unión de la CaM a las catalasas vegetales, se midieron las actividades catalíticas de la atcat3 recombinante y la catalasa de tabaco purificado en presencia y ausencia de CaCl2 y CaM., Experimentos similares también se llevaron a cabo mediante el uso de otras catalasas no vegetales. El AtCat3 recombinante expresado por E. coli no mostró actividad. Resultados similares se obtuvieron en otro laboratorio (Zhixiang Chen, comunicación personal). Esto puede haber resultado de la falla en formar la estructura correcta para la catalasa recombinante, porque la catalasa activa es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades idénticas o similares (6, 10, 26). Por el contrario, la catalasa de tabaco purificado mostró un cambio significativo en la actividad dependiente de Ca2+/CaM durante las etapas de purificación (Tabla 1)., Los efectos estimulantes de Ca2+ / CaM son aproximadamente 2,2 veces en cada paso, excepto la muestra que se obtuvo después de la cromatografía CaM-Sefarosa. Mostró una mayor estimulación de la actividad de la catalasa (2,5 veces) posiblemente debido a la eliminación de la fracción de catalasa de unión no Ca2+ / CaM (Tabla 1). La fracción catalasa de unión no Ca2+ / CaM tuvo una actividad específica de 59,6 unidades (actividad basal). Sin embargo, Ca2+/CaM no estimuló la actividad de esta fracción de catalasa (datos no mostrados)., Estos resultados indican que Ca2+ / CaM es capaz de activar la catalasa de tabaco en la fracción que se obtuvo después de la cromatografía CaM-Sefarosa, que corresponde a los resultados de unión CaM. Para comparar los efectos de Ca2+ / CaM sobre la actividad de catalasas de diferentes fuentes, se utilizó la actividad relativa, ya que existe una diferencia significativa en la actividad específica de catalasas de diferentes especies. Por ejemplo, A. niger catalasa tiene la actividad específica de 5.7 unidades; catalasa de hígado de bovino, el 51,9 unidades; los eritrocitos humanos, el 39,5 unidades; tabaco catalasa, 63.,1 unidades (en ausencia de Ca2+ / CaM). Higo. 4a muestra que CaCl2 solo o CaM solo no tuvo ningún efecto estimulante sobre la actividad de la catalasa del tabaco (alrededor del 40% de la actividad máxima). No se observaron diferencias en la actividad catalítica en catalasas fúngicas, bovinas o humanas en presencia o ausencia de Ca2+, CaM y Ca2+ / CaM (Fig. 4A). Al reemplazar CaCl2 por MgCl2, no hubo cambios significativos en la actividad de la catalasa del tabaco en presencia o ausencia de MCA (datos no mostrados)., Para documentar el efecto de Ca2 + / CaM sobre la actividad de la catalasa vegetal, se agregaron 10 µM del péptido correspondiente a la región de unión de CaM AtCat3 (415-451) a cada mezcla de reacción. Las catalasas no vegetales no se vieron afectadas por la adición del péptido. Sin embargo, el efecto estimulante de Ca2+/CaM sobre la actividad de la catalasa del tabaco fue abolido por la adición del péptido (Fig. 4A). Además, el efecto inhibitorio del péptido sobre la actividad de la catalasa del tabaco dependía de la concentración del péptido (Fig. 4B)., La actividad de la catalasa fue inhibida en aproximadamente un 58%, que está cerca de la actividad basal de la catalasa. Sin embargo, el péptido no tuvo ningún efecto sobre la actividad de la catalasa bovina en todas las concentraciones probadas (Fig. 4A). Estos resultados sugieren que Ca2+ / CaM tiene un efecto estimulante sobre la catalasa de la planta purificada, pero no tiene ningún efecto sobre las catalasas no vegetales.

se sabe que la catalasa es una enzima peroxisomal predominante, pero también existe en las mitocondrias y el citoplasma (32). Por ejemplo, el maíz Cat3, que podría ser una catalasa de unión CaM basada en la comparación de secuencias de aminoácidos, es una proteína mitocondrial (33). Nuestros resultados (Figs. 1-4) demuestran que la CaM se une a la catalasa vegetal y regula su actividad. Para demostrar la presencia de esta actividad reguladora in vivo, estudiamos si la CaM coexiste con la catalasa en los peroxisomas de plantas., Orgánulos de extractos etiolados de cotiledón de calabaza fueron separados por centrifugación de densidad de sacarosa. Para eliminar la contaminación de proteínas citosólicas que pudieran estar presentes en la solución o simplemente asociadas a la membrana peroxisomal, los peroxisomas aislados fueron tratados con proteinasa K. de esta manera, las proteínas peroxisomales protegidas de la proteasa por la membrana peroxisomal no fueron digeridas (34, 35). La identidad de las fracciones peroxisomales se demostró midiendo la actividad de la catalasa (35)., La CaM está muy conservada en todos los reinos (13-16), por lo que hicimos un análisis Occidental con un anticuerpo anti-CaM humano. Como control, se utilizó la CaM recombinante pcm6 (Fig. 5, carril 3). Curiosamente, una banda de un tamaño similar al PCM6 estaba presente en las fracciones peroxisomales, pero la intensidad fue considerablemente menor en comparación con la CaM citosólica (Fig. 5). Estos resultados indican que la CaM y la catalasa se colocalizan en los peroxisomas. La CaM es una pequeña proteína ácida que se expresa principalmente en el citoplasma., Sin embargo, en las plantas, se ha demostrado que la CaM está presente en varios orgánulos como el núcleo y los cloroplastos (36, 37) y la matriz extracelular (38). Además, existen proteínas reguladas por CaM en la matriz extracelular, el núcleo y los cloroplastos (38-40). Cómo CaM cruza la membrana no está claro. Estudios recientes indican que las modificaciones postraduccionales juegan un papel en la translocación de algunas isoformas CaM. Por ejemplo, una proteína similar a la petunia CaM, CaM53, se asocia con la membrana plasmática cuando la proteína está prenilada. Si se inhibe la prenilación, la CaM53 se encuentra predominantemente en el núcleo (41).,

Para nuestro conocimiento, no hay ningún informe que analiza la concentración de calcio en los peroxisomas., Basado en un modelo modificado reciente de la biogénesis del peroxisoma, el peroxisoma se origina a partir del retículo endoplásmico (RE) por medio de vesículas preperoxisomales (42). Se sabe que el ER es una de las piscinas intracelulares de calcio. Por lo tanto, la concentración de calcio en los peroxisomas podría ser tan alta como en la sala de emergencias. La medición de la concentración de calcio peroxisomal y el monitoreo de cualquier relación entre el cambio de la concentración de calcio en el citoplasma y el peroxisoma deben ayudar en nuestra comprensión de cómo la catalasa peroxisomal es regulada por Ca2+/CaM., Por ejemplo, la concentración de calcio libre podría medirse en las plantas transgénicas con la aequorina reconstituida con una señal de selección de peroxisoma. La aequorina es una proteína luminiscente sensible al calcio, cuya luminiscencia informa directamente del cambio de calcio (43). Debido a que el peroxisoma es un orgánulo importante que elimina los ERO tóxicos, principalmente el H2O2, es razonable especular que la actividad de la catalasa peroxisomal permanece alta todo el tiempo para degradar el H2O2 in situ a un ritmo rápido. Sin embargo, las fluctuaciones en el calcio citosólico podrían tener un efecto importante en la actividad de la citosólica catalasa., Es importante destacar que no todas las catalasas son proteínas de unión a CaM. Por lo tanto, se necesitan más investigaciones para abordar la importancia de Ca2+/CaM en el control de la actividad de la catalasa en diferentes orgánulos.

Las tensiones bióticas y abióticas desencadenan una afluencia de Ca2+, y el aumento del Ca2+ citosólico estimula la producción de H2O2, que se difunde en las células circundantes como mensajero e induce la respuesta fisiológica (19, 20). Nuestros resultados sugieren que el aumento de Ca2 + citosólico puede reducir los niveles de H2O2 mediante la estimulación de la actividad de la catalasa mediada por Ca2+ / CaM (Fig. 4)., Proponemos que el aumento de Ca2 + citosólico tiene un doble papel en la regulación de la homeostasis de H2O2 (Fig. 6): (i) la regulación positiva genera H2O2 activando directamente la NADPH oxidasa, que tiene afinidad con Ca2+ (22) e indirectamente produciendo más NADPH por medio de la nad quinasa regulada por Ca2+/CaM (23); y (II) la regulación negativa reduce H2O2 estimulando la actividad de la catalasa a través de la modulación Ca2+/CaM (Fig. 4)., Los cambios inducidos por la señal en los transitorios de Ca2 + pueden diferir en la frecuencia, duración, amplitud y localización espacial de las oscilaciones, y el modo de propagación espacial, lo que conduce a efectos diferenciales en las proteínas objetivo de calcio (12, 44).