DISCUSSION
La tinción de Gram es el procedimiento de tinción más utilizado en bacteriología. Se llama tinción diferencial ya que diferencia entre bacterias Gram-positivas y gram-negativas. Las bacterias que se tiñen de púrpura con el procedimiento de tinción de Gram se denominan Gram-positivas; las que se tiñen de rosa se dice que son Gram-negativas. Los Términos positivo y negativo no tienen nada que ver con la carga eléctrica, sino que simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias.,
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas se tiñen de manera diferente debido a diferencias fundamentales en la estructura de sus paredes celulares. La pared celular bacteriana sirve para dar al organismo su tamaño y forma, así como para prevenir la lisis osmótica. El material en la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
en micrografías electrónicas, la pared celular Gram-positiva aparece como una pared ancha y densa de 20-80 nm de espesor y que consiste en numerosas capas interconectadas de peptidoglicano (Figuras 1a y 1b). Químicamente, del 60 al 90% de la pared celular grampositiva es peptidoglicano., Entretejidos en la pared celular de los grampositivos están los ácidos teicoicos. Los ácidos teicoicos, que se extienden a través y más allá del resto de la pared celular, están compuestos de polímeros de glicerol, fosfatos y el alcohol de azúcar ribitol. Algunos tienen un lípido Unido (ácido lipoteicoico). La superficie externa del peptidoglicano está salpicada de proteínas que difieren con la cepa y la especie de la bacteria.,
la pared celular gramnegativa, por otro lado, contiene solo 2-3 capas de peptidoglicano y está rodeada por una membrana externa compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, lipoproteínas y proteínas (Figuras 2a y 2B). Solo el 10% – 20% de la pared celular Gram-negativa es peptidoglicano. Los fosfolípidos se encuentran principalmente en la capa interna de la membrana externa, al igual que las lipoproteínas que conectan la membrana externa con el peptidoglicano., Los lipopolisacáridos, ubicados en la capa externa de la membrana externa, consisten en una porción de lípidos llamada lípido a incrustado en la membrana y una porción de polisacáridos que se extiende hacia afuera desde la superficie bacteriana. La membrana externa también contiene una serie de proteínas que difieren con la cepa y la especie de la bacteria.,
para obtener más información sobre la pared celular Gram-negativa y Gram-positiva, consulte los siguientes objetos de aprendizaje en su guía de conferencias:
- La Pared Celular procariótica; Unidad 1, Sección IIB2
- La Pared Celular Gram-positiva; Unidad 1, Sección IIB2a
- La Pared Celular Gram-negativa; Unidad 1, Sección IIB2b
el procedimiento de tinción de Gram implica cuatro pasos básicos:
1. Las bacterias se tiñen primero con el tinte básico cristal violeta. Tanto las bacterias Gram-positivas como las Gram-negativas se tiñen directamente y aparecen de color púrpura después de este paso.,
2. Las bacterias se tratan con la solución de yodo de Gram. Esto permite que la mancha se retenga mejor formando un complejo cristalino insoluble de violeta-yodo. Tanto las bacterias Gram-positivas como las Gram-negativas permanecen moradas después de este paso.
3. Luego se agrega el decolorante de Gram, una mezcla de alcohol etílico y acetona. Este es el paso diferencial. Las bacterias Gram-positivas retienen el complejo cristalino violeta-yodo mientras que las Gram-negativas se decoloran.
4. Finalmente, se aplica la safranina (también un tinte básico)., Dado que las bacterias grampositivas ya están teñidas de púrpura, no se ven afectadas por la contra-tinción. Las bacterias gramnegativas, que ahora son incoloras, se tiñen directamente con la safranina. Por lo tanto, los Gram-positivos aparecen de color púrpura, y los Gram-negativos aparecen de color rosa.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, autores, con licencia de uso, ASM MicrobeLibrary.,
con la teoría actual detrás de la tinción de Gram, se cree que en las bacterias Gram-positivas, la violeta cristalina y el yodo se combinan para formar una molécula más grande que precipita dentro de la célula. La mezcla de alcohol/acetona entonces causa deshidratación del peptidoglicano de múltiples capas, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y haciendo que la pared celular atrape el complejo cristalino violeta-yodo dentro de la célula., En el caso de las bacterias gramnegativas, la mezcla alcohol / acetona, al ser un disolvente lipídico, disuelve la membrana externa de la pared celular y también puede dañar la membrana citoplasmática a la que se une el peptidoglicano. Las pocas capas de peptidoglicano son incapaces de retener el complejo violeta-yodo cristalino y la célula se decolora.
es importante tener en cuenta que la Gram-positividad (la capacidad de retener el complejo violeta-yodo de cristal púrpura) no es un fenómeno de todo o nada, sino una cuestión de grado., Hay varios factores que podrían resultar en una tinción Gram-negativa de un organismo Gram-positivo:
1. El método y las técnicas utilizadas. El sobrecalentamiento durante la fijación del calor, la decoloración excesiva con alcohol e incluso el lavado excesivo con agua entre pasos puede provocar que las bacterias grampositivas pierdan el complejo violeta-yodo cristalino.
2. La era de la cultura. Los cultivos de más de 24 horas de edad pueden perder su capacidad de retener el complejo violeta-yodo cristalino.
3. El organismo mismo., Algunas bacterias Gram-positivas son más capaces de retener el complejo cristal violeta-yodo que otras.
por lo tanto, se deben utilizar técnicas muy precisas en la tinción de Gram e interpretar los resultados con discreción.
cultivos de placa de agar de soja Tripticasa de Escherichia coli (un pequeño bacilo Gram negativo) y Staphylococcus epidermidis (un coccus Gram positivo con un arreglo de estafilococo).
procedimiento (a realizar individualmente)
1., Escherichia coli
a. heat-fix a smear of Escherichia coli as follows:
1. Usando la botella gotero de agua desionizada que se encuentra en la rejilla de tinción, coloque 1/2 de una gota de agua de tamaño normal en un portaobjetos limpio tocando el gotero con el portaobjetos (Figura 1). Altenately, utilice su lazo esterilizado de la inoculación para colocar una gota del agua desionizada en la diapositiva.
2., Usando su asa de inoculación estéril, retire asépticamente una pequeña cantidad del cultivo de la superficie de agar y tóquelo suavemente 2-3 veces hasta la gota de agua hasta que el agua se vuelva visiblemente turbia (Figura 2). Un buen frotis con la cantidad correcta de bacterias es esencial para la tinción de Gram.
- demasiadas bacterias en el portaobjetos podrían resultar en una decoloración insuficiente; muy pocas podrían conducir a una decoloración excesiva.
3. Incinerar las bacterias restantes en el circuito de inoculación., Si se agrega demasiado cultivo al agua, no verá bacterias individuales manchadas y es posible que no tenga una tinción de Gram confiable.
4. Después de que el bucle de inoculación se enfríe, extienda la suspensión sobre aproximadamente la mitad del portaobjetos para formar una película delgada. Un frotis correctamente preparado con la cantidad correcta de bacterias debe ser similar a la Fig. 3.
5. Deje que esta suspensión delgada se seque completamente al aire (Figura 4). ¡El frotis debe estar completamente seco antes de que la diapositiva se fije con calor!
6., Para fijar con calor las bacterias al portaobjetos, levante el portaobjetos secado al aire con unas pinzas para el cubreobjetos y sostenga la parte inferior del portaobjetos frente al frotis cerca de la abertura del microincinerador durante 10 segundos (Figura 5) como lo demostró su instructor. Si el portaobjetos no se calienta lo suficiente, todas las bacterias se lavarán. Si se sobrecalienta, la integridad estructural de las bacterias puede dañarse.
b. tinción con Violeta Cristal de Hucker durante un minuto (Figura 6). Lavar suavemente con agua (Figura 7). Sacuda el exceso de agua, pero no seque entre pasos.
c., Teñir con solución de yodo de Gram durante un minuto (Figura 8) y lavar suavemente con agua.
D. decolorar recogiendo la diapositiva y dejando que el decolorante del gramo corra por la diapositiva hasta que el morado simplemente deje de fluir en la parte inferior de la diapositiva (Figura 9).
- asegúrese de que todo el frotis está decolorado uniformemente y que no está decolorando o decolorando demasiado.
- Lavar inmediatamente con agua.
e. tinción con safranina durante un minuto (Figura 10)., Cuando lave el exceso de safranina, tenga mucho cuidado de lavarse suave y brevemente, ya que es posible lavar parte de la sarfanina en la bacteria.
f. secar (Figura 11) y observar usando microscopía de inmersión en aceite.
2. Staphylococcus epidermidis
a. fije un frotis de Staphylococcus epidermidis de la siguiente manera:
1. Usando la botella gotero de agua desionizada que se encuentra en la rejilla de tinción, coloque 1/2 de una gota de agua de tamaño normal en un portaobjetos limpio tocando el gotero con el portaobjetos (Figura 1)., Altenately, utilice su lazo esterilizado de la inoculación para colocar una gota del agua desionizada en la diapositiva.
2. Usando su asa de inoculación estéril, retire asépticamente una pequeña cantidad del cultivo de la superficie de agar y tóquelo suavemente 2-3 veces hasta la gota de agua hasta que el agua se vuelva visiblemente turbia (Figura 2).
- demasiadas bacterias en el portaobjetos podrían resultar en una decoloración insuficiente; muy pocas podrían conducir a una decoloración excesiva.
3. Incinerar las bacterias restantes en el circuito de inoculación., Si se agrega demasiado cultivo al agua, no verá bacterias individuales manchadas y es posible que no tenga una tinción de Gram confiable.
4. Después de que el bucle de inoculación se enfríe, extienda la suspensión sobre aproximadamente la mitad del portaobjetos para formar una película delgada (figura 3).
5. Deje que esta suspensión delgada se seque completamente al aire (Figura 4). ¡El frotis debe estar completamente seco antes de que la diapositiva se fije con calor!
6., Para fijar con calor las bacterias al portaobjetos, levante el portaobjetos secado al aire con unas pinzas para el cubreobjetos y sostenga la parte inferior del portaobjetos frente al frotis cerca de la abertura del microincinerador durante 10 segundos (Figura 5) como lo demostró su instructor. Si el portaobjetos no se calienta lo suficiente, todas las bacterias se lavarán. Si se sobrecalienta, la integridad estructural de las bacterias puede dañarse.
b. tinción con Violeta Cristal de Hucker durante un minuto (Figura 6). Lavar suavemente con agua (Figura 7). Sacuda el exceso de agua, pero no seque entre pasos.
c., Teñir con solución de yodo de Gram durante un minuto (Figura 8) y lavar suavemente con agua.
D. decolorar recogiendo la diapositiva y dejando que el decolorante del gramo corra por la diapositiva hasta que el morado simplemente deje de fluir en la parte inferior de la diapositiva (Figura 9).
- asegúrese de que todo el frotis está decolorado uniformemente y que no está decolorando o decolorando demasiado.
- Lavar inmediatamente con agua.
e. tinción con safranina durante un minuto (Figura 10)., Cuando lave el exceso de safranina, tenga mucho cuidado de lavarse suave y brevemente, ya que es posible lavar parte de la sarfanina en la bacteria.
f. secar y observar usando microscopía de inmersión en aceite.
3. Asegúrese de verter cuidadosamente el tinte usado en su bandeja de tinción en el recipiente de recolección de tinte de desecho, no en el fregadero.
B., La tinción de la cápsula
discusión
muchas bacterias secretan una cubierta viscosa y viscosa llamada cápsula o glicocalix . Esto se compone generalmente de polisacárido, polipéptido,o ambos.
la capacidad de producir una cápsula es una propiedad heredada del organismo, pero la cápsula no es un componente celular absolutamente esencial. Las cápsulas a menudo se producen solo bajo condiciones de crecimiento específicas. Aunque no es esencial para la vida, las cápsulas p robablemente ayudan a las bacterias a sobrevivir en la naturaleza., Las cápsulas ayudan a muchas bacterias patógenas y normales de la flora a resistir inicialmente la fagocitosis por las células fagocíticas del huésped. En el suelo y el agua, las cápsulas ayudan a evitar que las bacterias sean absorbidas por los protozoos. Las cápsulas también ayudan a que muchas bacterias se adhieran a las superficies y, por lo tanto, resistan el enrojecimiento. También permite que muchas bacterias formen biopelículas. Un biofilm consiste en capas de poblaciones bacterianas adheridas a las células huésped e incrustadas en una masa capsular común.,
para obtener más información sobre las cápsulas bacterianas, consulte los siguientes objetos de aprendizaje en su guía de conferencias:
- El glicocalix (cápsula) y la capa S; Unidad 1, Sección IIB4a
- La capacidad de resistir el envolvimiento fagocítico; Unidad 3, Sección B5B
Organismo
cultivo de caldo de leche descremada de Enterobacter aerogenes. La leche descremada suministra nutrientes esenciales para la producción de cápsulas y también proporciona un fondo ligeramente manchable.
procedimiento (a realizar individualmente)
1., Revuelva el cultivo de caldo de leche descremada con su bucle y Coloque 2-3 bucles de Enterobacter aerogenes en un portaobjetos de microscopio.
2. Usando su bucle de inoculación, extienda la muestra para cubrir aproximadamente una pulgada del portaobjetos.
3. Deje que se seque completamente al aire. No caliente la solución. Las cápsulas se adhieren bien al vidrio, y el calor puede destruir la cápsula.
4. Mancha con cristal violeta durante un minuto.
5. Lave el exceso de tinte con una solución de sulfato de cobre al 20%.
6. Sacuda el exceso de solución de sulfato de cobre e inmediatamente seque.
7. Observe el uso de microscopía de inmersión en aceite., El organismo y la leche seca en el portaobjetos recogerán el tinte púrpura mientras que la cápsula permanecerá incolora.
8. Asegúrese de verter cuidadosamente el tinte usado en su bandeja de tinción en el recipiente de recolección de tinte de desecho, no en el fregadero.
9. Observe la tinción de cápsula de demostración de Streptococcus lactis, una bacteria encapsulada que es flora normal en la leche.
A. La Tinción de Gram
Realizar los dibujos de cada bacteria en su tinción de Gram de la preparación.,
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| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., La tinción de cápsula
haga un dibujo de su preparación de tinción de cápsula de Enterobacter aerogenes y la tinción de cápsula de demostración de Streptococcus pneumoniae.
tinción de cápsula de Streptococcus lactis
