se necesita un esfuerzo real para mantener sus conocimientos básicos de Biología molecular y celular frescos, además de todo lo demás que tiene que hacer. ¿No sería genial si hubiera un lugar donde pudiera encontrar artículos fáciles de leer que le permitan repasar esos conceptos básicos en solo un par de minutos?
hope espero que haya dicho «sí», porque este es el objetivo de mi serie de artículos» lo básico:», que ya hemos, y continuaremos, traerles periódicamente. Este artículo explica los conceptos básicos de la ligadura de ADN.,
su compañero de ligadura de ADN: ligasa de ADN
la ligasa de ADN (EC 6.5.1.1) es la enzima en el corazón de la reacción de ligadura de ADN. Se une covalentemente a la columna vertebral de fosfato del ADN con extremos cohesivos Romos o compatibles (ver Figura 1) y su papel natural es reparar roturas de doble hebra en moléculas de ADN. En Biología molecular se utiliza comúnmente para la inserción de fragmentos de ADN generados por enzimas de restricción en las espinas dorsales del vector. Las ligasas comerciales se suministran con un tampón de reacción que contiene ATP y Mg2+, que son esenciales para la actividad de la ligasa., Dado que el ATP puede ser dañado por ciclos repetidos de congelación y descongelación, es aconsejable hacer alícuotas del tampón (ver mi artículo «5 consejos de ligadura de ADN»).
la Figura 1. Extremos cohesivos y romos, listos para la ligadura de ADN!
los dos pasos de la reacción de ligadura de ADN
la reacción de ligadura de ADN en sí tiene dos pasos básicos. En primer lugar, los extremos del ADN tienen que chocar por casualidad y permanecer juntos el tiempo suficiente para que la ligasa se una a ellos. Esta es la parte más ineficiente de la reacción, pero es más fácil a bajas temperaturas. ¿Por qué?, Bueno, como probablemente sabrán, todas las moléculas se mueven más rápido a temperaturas más altas, por lo que pueden imaginar que será más fácil que dos extremos de ADN colisionen y permanezcan juntos si flotan suavemente a través de la solución a baja temperatura, en lugar de zumbar como lo harían a temperaturas más altas. Para los extremos cohesivos, hay una razón adicional; temperaturas más bajas estabilizan el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos complementarios, lo que realmente ayuda a mantener las cosas en su lugar.
la Figura 2., Reacción enzimática de la ligadura de ADN
el segundo paso es la reacción enzimática, que se muestra esquemáticamente en la Figura 2.. La ADN ligasa cataliza la Unión del 3′-OH al 5 ‘ – fosfato a través de un mecanismo de dos pasos. Primero, el nucleótido AMP, que se une a un residuo de lisina en el sitio activo de la enzima, se transfiere al 5’-fosfato. Entonces el enlace AMP-fosfato es atacado por el 3 ‘ – OH, formando el enlace covalente y liberando AMP. Para permitir que la enzima lleve a cabo reacciones adicionales, el AMP en el sitio activo de la enzima debe ser reabastecido por ATP.,
he aquí por qué llevar a cabo la ligadura de ADN a bajas temperaturas puede ayudar
la enzima ADN ligasa tiene una actividad óptima a 25°C, Por lo que la reacción de ligadura se lleva a cabo a una temperatura que es un compromiso entre las temperaturas óptimas para unir los extremos de ADN (1°C) y la reacción enzimática (25°C). Normalmente 1hr a 16 ° C está bien, pero ya que unir los extremos del ADN es la parte menos eficiente de la reacción, favoreciendo esto al bajar la temperatura a 4°C puede dar aún más eficiencia. Sin embargo, la enzima se trabaja muy lentamente a esta temperatura tan largo (por ejemplo,, durante la noche) se requiere tiempo de incubación.
publicado originalmente el 31 de octubre de 2007; actualizado y republicado el 5 de diciembre de 2014.
Tiene esto ha ayudado? Entonces por favor comparta con su red.
