Good Mood

resultados

muestras no tratadas. En particular, observamos que, incluso en muestras sin manchas, las diferencias entre las gotas de agua y aceite (Fig. 1 B y C)o entre diferentes constituyentes de la célula (Fig. 1D) generar suficiente contraste para distinguirlos. En las células, los materiales más altos en Z, como las sales, El fósforo y el hierro, que pueden estar concentrados en diferentes regiones, tienden a mejorar el contraste. Higo., 1D muestra una célula de ovario de hámster chino (CHO) no tratada en medio de cultivo normal a temperatura ambiente. El contorno celular y el núcleo con su estructura interna son claramente visibles, al igual que una serie de partículas oscuras y esféricas en el citoplasma. La identificación de estas partículas como gotas lipídicas se discute a continuación.

tinción de metales pesados. Los límites de resolución y contraste al observar materiales de baja Z sugieren que se pueden lograr ventajas sustanciales al teñir las células con marcadores de alta Z, como manchas densas de electrones o etiquetas de oro de nanopartículas., De hecho, somos capaces de detectar perlas de oro en agua hasta un diámetro de 10 nm mediante el uso de membranas ultrafinas (datos no mostrados).

la tinción diferencial de orgánulos dentro de las células utilizando materiales electrondense es un estándar en la técnica EM, aunque no se aplica generalmente para SEM. Higo. 2 muestra una rica variedad de estructuras dentro de las células cultivadas que se cultivaron directamente en la membrana de partición y luego se fijaron y teñieron con acetato de uranilo (8). Los orgánulos intracelulares son claramente visibles, incluyendo detalles internos de mitocondrias (Fig. 2C), fibras de tensión de actina (Fig., 2D), y estructuras tubulares y citoesqueléticas complejas (Fig. 2 A y B). La energía de haz más alta en la Fig. 2C sondas estructura interna, mientras que a menor energía (Fig. 2D), se visualiza la superficie cercana a la membrana. Así, diferentes energías pueden ser utilizadas para obtener información tridimensional.

marcadores de oro de nanopartículas. La alta resolución y la especificidad de la detección se pueden lograr mediante la Unión de anticuerpos u otros ligandos., Al igual que con otros métodos EM, el etiquetado se realiza más convenientemente mediante el uso de nanopartículas de oro. En contraste con transmission EM (TEM), que muestrea solo secciones muy delgadas y a menudo arbitrarias, el SEM húmedo permite un cambio rápido entre la vista local y global del etiquetado en toda la celda. Higo. 3 A y B muestran cómo los anticuerpos monoclonales del receptor del factor de crecimiento antiepidérmico con etiqueta dorada de nanopartículas de 40 nm se utilizaron para etiquetar los receptores del factor de crecimiento epidérmico en células cancerosas A431 intactas., La fijación es a menudo útil y conveniente incluso en SEM húmedo y puede facilitar el etiquetado, así como la transferencia al microscopio. Las células aquí presentadas también están teñidas con acetato de uranilo, lo que permite la alineación de los receptores Etiquetados con la estructura general de las células. El alto contraste y el tamaño uniforme de las nanopartículas permiten una identificación y localización inequívoca. Conocer la localización precisa de moléculas de un solo receptor abre la posibilidad de medir eventos como la dimerización del receptor inducida por el factor de crecimiento epidérmico., La tinción de las células no es necesaria para el etiquetado, y hemos incluido una imagen de células etiquetadas sin teñir (Fig. 7, que se publica como información de apoyo en el sitio web de la PNAS). También se muestra una imagen que demuestra que el marcado de las partes internas de la célula es posible (Fig. 8, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS), en este caso, el marcado de las mitocondrias con cuentas de oro. El etiquetado de los filamentos de actina dentro de las células también se ha logrado mediante el uso de partículas de oro subnanómetro, seguido de realce de plata (datos no mostrados).

Un ejemplo de etiquetado oro en las bacterias se presenta en la Fig. 3C . Aquí, el receptor putativo de gastrina de Helicobacter pylori (9) se detecta por incubación con complejos de gastrina biotinilada y nanopartículas de oro de 20 nm recubiertas de estreptavidina. La administración de la gastrina biotinilada antes de la del oro recubierto de estreptavidina no produjo casi ninguna unión de nanopartículas a la bacteria. Este resultado se obtuvo independientemente del tiempo entre los dos pasos, lo que sugiere que la captación de gastrina en H. pylori es casi inmediata., El hecho de que la gastrina complejada no entrara en las células apunta a la posibilidad de definir los límites del tamaño de las partículas que pueden ser internalizadas por las bacterias.

comparación de técnicas de imagen (Trypanosoma brucei). Es útil comparar esta tecnología con las técnicas de imagen existentes utilizando un sistema de un solo modelo. Este estudio se detalla en la Fig. 4, utilizando el parásito T. brucei forma procíclica que se propaga en el intestino medio de la mosca tsetsé. Las tres primeras imágenes muestran los modos de imagen existentes: microscopía óptica de fluorescencia (Fig., 4a), microscopía de contraste de interferencia diferencial (Fig. 4B), Y TEM (Fig. 4C). La fuerza de las técnicas existentes Es evidente: marcado localizado en fluorescencia y secciones detalladas en TEM. La óptica no tratada (Fig. 4B)y SEM húmedo (Fig. 4D) las imágenes delinean los bordes de la celda, pero son de bajo contraste y carecen de detalle. Ambos enfatizan el núcleo, pero otros orgánulos que aparecen en la imagen de contraste de interferencia diferencial no están claramente identificados, mientras que la imagen de SEM húmedo saca las gotitas de lípidos a una ventaja. Tinción de tetróxido de osmio (Fig., 4E) no es tan útil en este sistema, enfatizando principalmente las gotitas lipídicas y algunos orgánulos internos no identificados. La imagen más fuerte se ve en la Fig. 4F, para el que se utilizó tinción de acetato de uranilo. La ventaja de la imagen intacta con la que se puede ver la célula completa (junto con sus finas estructuras internas que se pueden observar en detalle) es evidente, especialmente en comparación con la imagen TEM (Fig. 4C). Por último, en la Fig.10 se muestra la imagen sem húmeda del marcado específico de células enteras con anticuerpos contra la principal proteína EP prociclina de la capa superficial anclada a glicosilfosfatidilinositol., 4 G Y H . Curiosamente, se sabe que la PROCICLINA EP cubre toda la célula de manera uniforme, pero la señal observada está agrupada. Atribuimos esto a la tendencia de las balsas lipídicas subyacentes a agruparse bajo la influencia de anticuerpos, un proceso que la fijación en formaldehído no puede evitar. Los marcadores de oro también dilucidan la conformación tridimensional de la célula de una manera que recuerda a lo que SEM estándar puede imagen (una excelente imagen SEM representativa de T. brucei se puede encontrar en http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

obviamente, TEM tendrá mejor resolución, en general, que SEM húmedo, pero las imágenes presentadas en el ejemplo de T. brucei para la comparación son imágenes «típicas» obtenidas en el mismo laboratorio., Debido a que el SEM húmedo es diferente en su utilidad que el TEM y la microscopía óptica, en T. brucei se puede ver como una importante capacidad complementaria, y se puede esperar que la imagen completa sea dada por una combinación de técnica óptica, TEM y SEM húmedo.

secciones de tejido. El SEM húmedo se puede utilizar para muestras gruesas, como fragmentos de tejido, simplemente montando la muestra contra la membrana. La profundidad de muestreo limitada de los BSE permite obtener imágenes de una» sección virtual», que se extiende desde la superficie hasta una profundidad definida de hasta unos pocos micrómetros sin la necesidad de cortes finos.,

Fig. 5 A y B muestra la visualización directa de tejidos no tratados de ratón. Higo. 5A es una imagen de pequeño aumento del tejido cardíaco. La organización de las células musculares es evidente. Zoom sobre una celda (Fig. 5B) da una visión vívida del núcleo y los orgánulos intracelulares, posiblemente mitocondrias, y su dispersión en la célula. Como se muestra anteriormente para las células cultivadas, la tinción de los tejidos es ventajosa pero no imprescindible y puede mejorar la visualización de muchas características. Higo. 5 C y D muestra una región de la corteza renal de una rata., La tinción (ferricianuro de potasio) acentúa la organización general y los contactos celulares dentro del epitelio de los túbulos renales. El ajuste cuidadoso de las condiciones de tinción e imagen puede revelar información diferente y complementaria, como la arquitectura del tejido; por ejemplo, los tejidos teñidos con acetato de uranilo producen una imagen clara de la matriz extracelular (datos no mostrados).

colección simultánea de fotones (CL). La detección de la EEB en SEM húmedo puede complementarse con la recogida simultánea de fotones., El haz de electrones de barrido excita moléculas en la muestra, que luego pueden emitir luz en longitudes de onda características (CL). La intensidad de la luz entonces se utiliza para derivar una imagen de la distribución de moléculas centelleantes, ya sea endógenas a la célula o etiquetas que se pueden introducir extraneously. Esta imagen se obtiene simultáneamente con la imagen por EEB a una resolución limitada por interacciones electrón–materia y no por difracción de luz (6). Insertamos una guía de luz en el fluido debajo de la muestra, que guía la luz emitida a un fotomultiplicador., Esta configuración logra un buen acoplamiento y una recolección eficiente de los fotones excitados por el haz de electrones sin comprometer la eficiencia de la detección concurrente de la EEB.

Fig. 6 muestra células CHO no tratadas, visualizadas simultáneamente por EEB y fotones. En La Fig. 6A, los bordes celulares están claramente delineados en el modo de imagen electrónica, y el núcleo (junto con sus nucléolos) son prominentes, al igual que los puntos oscuros ≈1-µm alrededor del núcleo. Estos aparecen en el citoplasma de todas las células eucariotas que investigamos, y aunque su número varía, suelen estar dispersos alrededor del núcleo., En la imagen CL mostrada en la Fig. 6B, el contorno celular y el núcleo están claramente definidos, indicativos de una distribución de moléculas centelleantes (similar a la autofluorescencia) en la célula. En este modo, las mismas manchas se caracterizan por una alta emisión de fotones. La combinación de una alta señal catodoluminiscente y un alto contenido de carbono es típica de las gotitas lipídicas (11), que participan en el almacenamiento de energía de la célula (12)., Una prueba independiente de adición de ácido oleico de 200 µM causó una fuerte proliferación de estas gotitas en la célula (datos no mostrados), consistente con la noción de que las manchas observadas son gotitas lipídicas.

el SEM húmedo tiene una ventaja sobre las técnicas SEM estándar en la preservación de lípidos, especialmente en agregados grandes como las gotitas de lípidos. La eliminación de la necesidad de secado ahorra los lípidos de disolventes orgánicos que pueden disolverlos. Aunque el tratamiento con osmio preservará algunas bicapas lipídicas, en agregados más grandes el osmio reacciona rápidamente para crear una corteza externa que no deja entrar el osmio, dejando a los agregados vulnerables al Tratamiento subsecuente con solventes orgánicos., En las preparaciones criogénicas, la tendencia del proceso de escisión a agrietarse a lo largo de los límites de lípidos y agua también es un peligro para las grandes estructuras lipídicas.

la obtención de imágenes de alta resolución de marcadores es una capacidad altamente deseable del modo de detección de CL, que requiere el desarrollo de etiquetas para moléculas específicas en las células. En La Fig. 9, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS, demostramos que las perlas fluorescentes estándar de 0,2 µm de diámetro emiten fotones intensamente bajo el haz de electrones y se pueden obtener imágenes con una resolución de ≈100 nm (7)., La obtención de imágenes de perlas más pequeñas está limitada por el bajo brillo, lo que implica el desarrollo de perlas de centelleo especializadas a un diámetro pequeño . Debido a que el mecanismo de excitación de centelleo es más fuerte cuando el haz está afectando directamente a la cuenta, esperamos que esto pueda extender la resolución de las imágenes fluorescentes un orden de magnitud más allá de la disponible con la microscopía óptica.