efecto de rbST en la producción de leche
La Tabla 2 muestra un resumen de la producción de leche para los grupos rbST y control expresado como media y desviación estándar de la producción de leche (Kg por día) en cada ciclo de tratamiento, así como la diferencia de producción entre ambos grupos (% de leche extra producida por el grupo rBST en comparación con los animales control)., Del ciclo 0 al ciclo 3, la producción de leche parece aumentar en ambos grupos, posiblemente indicando que los animales aún no habían alcanzado su pico de lactancia. Aunque la primera dosis de rbST se administró alrededor de los 2 meses después del parto, según lo recomendado por el fabricante, es importante señalar que esta recomendación se basa en modelos matemáticos que localizan el pico de producción de leche a los 60-90 días después del parto., Sin embargo, estos modelos son solo enfoques teóricos y los días en la leche (DIM) en el pico de la leche tienen una amplia variación entre rebaños y vacas, estando condicionados, entre otros factores, por el bienestar y la alimentación37. Desde el ciclo 4 hasta el final del estudio, se pudo vislumbrar una disminución en la producción de leche de las vacas control, mientras que los animales tratados con rbST parecían mantener su producción relativamente constante con un promedio de 30-35 kg de leche por día, mostrando una tendencia a la disminución obvia solo cuando se interrumpió el tratamiento hormonal (ciclos 14, 15 y 16)., En este punto, las diferencias de producción observadas entre los grupos volvieron a niveles muy cercanos a los observados en el ciclo 0. Es notable el hecho de que la producción de leche fue significativamente mayor en el grupo rbST que en el control durante todo el estudio, excepto durante el ciclo 6, cuando estos animales producían solo un 5% más que los sujetos de control (Tabla 2). De acuerdo con el patrón de administración quincenal de rbST recomendado por el fabricante, el día 70 el grupo de animales tratados debería haber recibido una nueva dosis de hormona de crecimiento recombinante., Sin embargo, esa dosis no se aplicó para poder evaluar si el grupo rbST podía recuperar el perfil transcripcional pre-dosis después de 28 días sin administración hormonal (Fig. 1). Posiblemente debido a esta falta de hormona, las diferencias estadísticamente significativas existentes en la producción de leche entre los dos grupos desaparecieron, destacando los efectos de rbST en las tasas de producción de leche (Tabla 2). En el día 84, se volvió a administrar rbST y reaparecieron las diferencias significativas en la producción de leche entre los dos grupos (24%)., Se observó una diferencia máxima de 43% más de leche en los animales tratados con respecto a las vacas control en el ciclo 12, ambos relacionados con una producción mantenida debido a rbST y un patrón natural decreciente en las hembras control. Curiosamente, estas diferencias significativas se mantuvieron hasta el final del estudio, casi dos meses después de la última dosis (12 dosis, día 168) fue administrada (Tabla 2).
aislamiento de ARN de células somáticas bovinas
Las MSCs son una fuente de ARN fácil de recolectar para estudios de expresión génica, ya que estas células pueden aislarse de leche cruda siguiendo un protocolo muy simple. Además, la recolección de muestras es barata y no invasiva, ya que la leche puede ser recolectada en la sala de ordeño sin contacto directo con el animal y por lo tanto sin causarle estrés que podría alterar los resultados obtenidos. En este estudio, el tratamiento con rbST no tuvo un efecto significativo (P = 0.,099) sobre la cantidad de ARN aislado de MSCs, con una concentración media de 120,69 ± 68,31 µg mL−1 en muestras del grupo rbST y 132,36 ± 68,86 µg mL−1 en muestras del grupo control. El valor promedio de la relación A260/280 fue de 1,766 ± 0,095. Es posible que un paso de purificación con columnas de espín aumentara la relación A260/280 y, por lo tanto, la pureza de las muestras de ARN. Aunque la inclusión de este paso aumenta el precio de la muestra en el análisis de rutina, permite obtener muestras con mayor pureza. El valor medio de RIN observado para las muestras analizadas fue de 6,88 ± 0.,82 algunos factores podrían afectar a la integridad de las muestras. Las muestras utilizadas en este estudio fueron células somáticas bovinas aisladas de leche. La leche se caracteriza por una microbiota compleja y las Rnasas derivadas de esa microbiota podrían ser responsables de una menor integridad de ARN. Además, algunas de las células somáticas presentes en la leche podrían degradarse parcialmente. Estos hechos también se observaron en un estudio que utilizó frotis vaginal bovino para estudios transcriptómicos con el objetivo de encontrar biomarcadores para rastrear el uso indebido de agentes anabolicos38., Además, el proceso de ordeño, recolección de leche y transporte al laboratorio podría, a pesar de llevarse a cabo con la mayor rapidez posible, afectar a la integridad del ARN.
efecto del rbST en los genes del eje somatotrópico
se seleccionó un conjunto de 18 genes (Tabla 1) para el diseño de las placas OpenArray® utilizadas en este estudio. Esta selección se basó en el potencial de estos genes para obtener una firma transcriptómica característica de rbST que podría usarse como estándar para controlar el ab(uso) de rbST en ganado lechero., Los estudios previos de expresión génica con rbST se diseñaron como estudios de dosis única y de muestreo único en tejido mamario post mortem27 o estudios de dosis múltiples (cinco dosis) con muestreo de sangre y músculo en vivo31. Estos métodos se consideran invasivos, relativamente caros y, por lo tanto, poco prácticos a efectos de control en las explotaciones lecheras. En el caso de la somatotropina, el control debe realizarse in vivo, ya que el objetivo final es evitar la entrada de la leche rbST-en el mercado lácteo.,
en este estudio, la expresión de IGF-1 solo fue detectada en todos los puntos de muestra en una vaca (vaca 7) tratada con rbST y no fue detectable en las CMM del grupo control. El hecho de que solo fue posible detectar el objetivo de IGF-1 en todos los puntos de muestra en una vaca puede indicar la existencia de diferentes respuestas locales de la glándula mamaria al rbST exógeno entre los individuos. La mayoría de las moléculas de IGF-1 que se encuentran en la circulación se unen con alta afinidad a una o más de las seis proteínas de unión IGF-1 conocidas (IGFBP-1–6) que modulan la biodisponibilidad de IGF-1 en los tejidos diana 39., Estudios previos han observado que rbST influye fuertemente en la regulación ascendente de IGFBP – 5 en el músculo esquelético de cattle31 y regula a la baja IGFBP-3 en tejido mamario32. Sin embargo, en este estudio, no se detectaron transcripciones de IGFBP-3 ni de IGFBP-5 en ningún momento. Este resultado podría deberse a que las CMM están compuestas principalmente de leucocitos40 en los que el efecto represivo de la IGFBP puede no ser tan importante como en el tejido mamario. Por lo tanto, tanto las proteínas de unión al IGF-1 como al IGF-1 se descartan como marcadores potenciales en las células somáticas en este estudio.,
otro componente clave del eje somatotrópico es el receptor IGF-1 (IGF-1R) que es el receptor de señalización primario para IGF-1 que media la mayoría de sus efectos biológicos. En el día 1, el grupo rbST (0,348 ± 0,131) tuvo significativamente (P < 0,001) mayor abundancia relativa de IGF-1R que el grupo control (0,0898 ± 0,0486). Diferentes estudios que evaluaron la concentración de rbST en sangre después de la administración observaron que las concentraciones más altas de esta hormona recombinante se encontraron después de la administración de rbst14,15., Por lo tanto, las diferencias significativas observadas en el grupo tratado podrían deberse a una respuesta al IGF-1 sintetizado como respuesta a las mayores concentraciones de rbST en vacas tratadas después de la administración de la primera dosis. En La Fig. 2, se puede observar que la abundancia relativa de IGF-1R para los dos primeros ciclos de administración de rbST también fue significativamente mayor en el grupo rbST que en el grupo de control en muchos puntos de muestra. Curiosamente, en el día 84 del estudio, la abundancia relativa de IGF-1R fue similar en el grupo rbST (0.070 ± 0.057) y en el grupo control (0.110 ± 0.030)., Este día coincidió con la sexta administración de rbST, y entre esta dosis y la quinta dosis hubo un intervalo de 28 días en lugar de 14 días. Por lo tanto, es posible que el grupo rbST recuperara el nivel fisiológico de IGF-1R después de varios días sin rbST, mostrando incluso efectos de retirada de la regulación a la baja en la transcripción de IGF-1R. Estos resultados indican que el IGF-1R es un posible buen candidato para su inclusión en un panel de genes para detectar el uso de rbST en granjas lecheras., Aunque otros autores no encontraron un efecto significativo del rbST en los niveles de IGF-1R en la musculatura esquelética31, en este estudio se observó una respuesta clara en los niveles de este transcripto de receptores en las CMM. En este sentido, los leucocitos, neutrófilos y monocitos pueden producir hormona de crecimiento e IGF-1 y expresar sus receptores que indican que las vías de señalización IGF-1/IGF-1R podrían ejercer funciones reguladoras sobre el sistema inmune incluyendo la proliferación de células inmunes41,42. La diferencia entre los dos estudios podría deberse a las diferentes matrices utilizadas., MSCS posiblemente podría responder mejor a los niveles más altos de IGF-1 circulante y aumentar el número de receptores para esta molécula en su membrana
abundancia relativa de IGF-1R y ccnd-1 en el primer y segundo ciclo de administración de rBST en el grupo control (n = 3) y en el grupo tratado (n = 6). Se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann–Whitney para comparar el rendimiento lácteo en cada ciclo entre el grupo tratado y el grupo control., Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado y ambos grupos control. *(p < 0.05), **(p < 0.01), ***(p < 0.001).
efecto del rbST sobre los genes relacionados con el sistema inmunitario
El factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleucina-1β (IL-1β) son dos citocinas estrechamente relacionadas con el sistema inmunológico43., Debido presumiblemente a su relación, fue posible identificar tendencias similares en la abundancia relativa de TNF e IL-1β a lo largo del estudio. La administración de rbST provocó un aumento significativo en la abundancia relativa de las transcripciones de TNF e IL-1β. Cabe mencionar que en los días 9, 23 y 35, las abundancias relativas de TNF e IL-1β fueron significativamente mayores en el grupo rbST en comparación con el grupo control (Fig. 3). Estos días corresponden a la segunda semana de ciclos de rBST, aproximadamente 7-9 días después de las inyecciones de Lactotropina®., Por lo tanto, es posible que los cambios transcriptómicos causados por rbST en estas dos citocinas sean más evidentes en la segunda semana de un ciclo de rBST. Curiosamente, el día 84 (28 días después de la 5a administración de rbST), no hubo diferencias significativas entre los grupos (Fig. 3). En este contexto, otros estudios previos han utilizado potentes tecnologías transcriptómicas para detectar el uso de agentes anabólicos en cattle26,38., Estos estudios también observaron un aumento de la transcripción de IL-1β, uno de ellos significativamente26, y esto es muy interesante porque el estudio referido utilizó células sanguíneas cuya composición es muy similar a la de las CMM, ya que tienen una alta proporción de glóbulos blancos. Sin embargo, los estudios mencionados anteriormente no encontraron un efecto de los agentes anabólicos sobre el TNF, mientras que la presente investigación encontró una fuerte influencia de la administración de rbST en la abundancia relativa de TNF., En este sentido, se ha reportado que la administración exógena de rbST durante la lactancia puede mejorar la respuesta inmune en las vacas 44. En realidad, los recuentos de células somáticas de la leche aumentaron más temprano y más rápido en vacas que sufren de mastitis coliforme cuando se administró rbst45. La hormona del crecimiento y su versión recombinante muestran la capacidad de modular la reacción inflamatoria y la defensa neutrófila de la glándula mamaria lactante bovina en vacas sanas y enfermas45. Esto podría explicar la regulación al alza del TNF y la IL-1β en vacas tratadas con rbST.,
en los estudios de detección mediante el uso de transcriptómica es muy difícil encontrar un gen específico que podría ser utilizado como gen muy confiable. Cabe señalar que tanto la IL-1β como el TNF pueden regularse al alza en otros procesos como la mastitis subclínica46,47. Diferentes estudios llevados a cabo en los Estados Unidos han observado que las grandes granjas tienen más probabilidades de adoptar rbST, lo que sugiere no solo un componente potencial del tamaño de la granja del uso y la rentabilidad de rbST,sino también un componente del operador (edad y educación) 48,49., La somatotropina recombinante ha sido frecuentemente reportada como una tecnología de manejo intensivo, asociada con el uso de otras tecnologías orientadas a la productividad y prácticas de manejo que son características de las granjas más grandes, siendo menos frecuente entre los pastores49,50. En este sentido, la mastitis subclínica provoca una reducción en la producción de leche en las vacas afectadas51. Por lo tanto, debería ser interesante combinar los datos de los ensayos transcriptómicos con los datos de producción de leche., También podría acompañarse de un ensayo microbiológico de leche de vacas sospechosas para detectar los principales patógenos asociados a la mastitis subclínica. Pero lo que realmente aumenta el potencial de discriminación es la inclusión de más genes en el panel.
efecto del rbST en el ciclo celular, proliferación, diferenciación y adhesión
se sabe que el rbST aumenta la síntesis de la leche al aumentar el recambio (proliferación/apoptosis) y la actividad de las células epiteliales mamarias, lo que indica que el rbST influye en las vías metabólicas que regulan el recambio / ciclo celular y el metabolismo52., El ciclo celular es controlado por ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas. De ellos, la ciclina D (endodificada por el gen CCND1) coordina la progresión del ciclo celular a través de la estimulación extracelular (por ejemplo, factor de crecimiento, disponibilidad de nutrientes) e impulsa la progresión de la fase G1 A S que resulta en mitosis celular. Sin embargo, la mayoría de las células adultas se mantienen en un estado de reposo conocido como fase G0, un estado de reposo, y pueden volver a entrar en el ciclo celular en la fase G1 bajo estimulación mitogénica apropiada53. En este estudio, se observó que el tratamiento con rbST influye fuertemente en la transcripción CCND1., Antes de la primera dosis de rbST, no hubo diferencias significativas entre los grupos control y rbST (Fig. 3). Sin embargo, después de la primera dosis, fue posible observar diferencias significativas entre los dos grupos en diferentes puntos de muestra. La abundancia relativa de CCND1 fue significativamente mayor en el grupo rbST que en el grupo control en los dos primeros ciclos de tratamiento con rbST (Fig. 2). Este efecto parece ser particularmente evidente 9 días después de la administración de rbST, de manera similar a las transcripciones de TNF e IL-1β., Así, en los días 9, 23 y 35 del estudio, la abundancia relativa de CCND1 fue significativamente mayor en el grupo rbST que en el grupo control (Fig. 3). Finalmente, en el día 84 (28 días después de la 5a administración de rbST), no hubo diferencias significativas entre los grupos (Fig. 3) como en el caso de las citocinas. Además, en el último día (219) de muestreo (51 días después de las últimas dosis de rbST), no hubo diferencias significativas (p > 0.05) entre el grupo rbST (0.433 ± 0.141) y el grupo control (0.430 ± 0.178)., Por lo tanto, la administración exógena de rbST causa una sobreexpresión de CCND1. Esto puede dar lugar a la activación de la célula en la fase G0, y en el caso particular del tejido mamario, a un aumento de la producción de leche mediante el aumento del número de células alveolares de la glándula mamaria54.
otros genes relacionados con el ciclo celular son la proteína tumoral tipo D52 2 (TPD52L2) y la sirtuina 2 (SIRT2). De manera similar a la observada para CCND1, TNF e IL-1β, fue posible encontrar una abundancia relativa significativamente mayor (P < 0.001) de transcripciones SIRT2 en el grupo rbST (1.,517 ± 0.199) que en el grupo control (0.506 ± 0.250)en el día 23 del estudio, pero en este caso solo durante el segundo ciclo de administración de rbST (Fig. 4). El aumento de los niveles de transcripciones CCND1 y SIRT2 después de la segunda administración de Lactotropina® en el grupo tratado podría ser el resultado de un efecto de rBST exógeno en el ciclo celular. La circulación de esta hormona peptídica en el organismo daría lugar a la activación del ciclo celular en las células diana., Sin embargo, en los otros ciclos rbST, la relación entre la administración de dosis y los cambios en la abundancia relativa de las transcripciones SIRT2 no fue tan evidente como en la segunda dosis. Además de lo anterior, es notable que el grupo tratado presentó una abundancia relativa significativamente mayor de transcripciones TPD52L2 (p < 0.05) durante 4 días después de la primera administración de rbST. Otro componente implicado en el metabolismo celular por su papel relevante en la traducción es el factor de elongación eucariótica 1 gamma (EEF1G).,
la Evolución de la abundancia relativa de algunos genes diana durante todos los puntos de la muestra del estudio en rbST grupo tratado (N = 6) y grupo control (N = 3).
en este estudio, la abundancia relativa de transcripciones de EEF1G no siguió una tendencia obvia relacionada con la administración de rbST., Sin embargo, en los días 17 y 30 (3 y 2 días después de la segunda y tercera dosis de rbST, respectivamente), la abundancia relativa de transcripciones de EEF1G fue significativamente mayor en el grupo de rbST. Un estudio anterior27 concluyó que el tratamiento con rbST aumenta los niveles de transcripciones de EEF1G en tejido mamario, pero solo utilizó un punto de muestra 6 días después de la administración de somatotropina. Por lo tanto, no es posible comparar directamente esos resultados con los obtenidos en este estudio, en el que se utilizaron 36 puntos de muestra para ensayos transcriptómicos a lo largo de 8 meses., Otro gen incluido en este estudio es el glóbulo de grasa láctea-proteína EGF factor 8 (MFGE8). En La Fig. 4, es posible observar que la abundancia relativa de MFGE8 en el grupo rbST tuvo gran variabilidad entre días de muestreo. En particular, McCoard et al.27 observaron que 6 días después de la administración de rbST, la abundancia relativa de MFGE8 en tejido mamario bovino fue mayor. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, ese estudio incluyó solo un punto de datos después de una dosis única de rbST., El presente experimento multidosis a largo plazo ha demostrado que los patrones de transcripción en bovinos tratados con rbST presentan una gran variabilidad a lo largo del tiempo. Por ejemplo, los datos obtenidos para CCND1 mostraron que el efecto de rbST en la transcripción de algunos genes aumenta con el número de dosis. Aunque es posible que rBST influya en la transcripción del gen MFGE8, los resultados obtenidos mostraron una regulación tanto hacia arriba como hacia abajo., Por lo tanto, el MFGE8 no puede ser sugerido como un candidato ideal para rastrear el uso de rBST (ab)en ganado, ya que no fue posible observar una clara tendencia en su transcripción. Otro gen relacionado con la adherencia celular evaluado en este estudio es catenina alfa-como 1 (CTNNAL1). Sin embargo, no fue posible encontrar diferencias significativas en su transcripción como resultado de la administración de rbST.
otros genes
la lactoferrina (LTF) es una glicoproteína de unión al hierro que pertenece a la familia de las transferrinas55., La figura 4 muestra la evolución de las abundancias relativas del gen LTF en todos los puntos de muestra evaluados en este estudio. Aunque en estudios previos con sustancias anabólicas en cattle38 se observó una regulación al alza de la LTF, no fue posible establecer una tendencia clara a la LTF en relación con el tratamiento con rbST. Por ejemplo, en los días 9 y 53, la abundancia relativa de LTF considerablemente menor en animales tratados con rbST. Sin embargo, en el día 91, la abundancia relativa fue considerablemente mayor en ese grupo. Es necesario discutir los resultados obtenidos para el gen de colágeno tipo III α 1 (COL3A1)., Un estudio previo concluyó que los tratamientos con rbST en ganado lechero causan una regulación ascendente del gen COL3A1 en el tejido mamario 6 días después de la administración de rbst27. Sin embargo, en el presente trabajo no fue posible detectar transcripciones del gen COL3A1. Tampoco se detectó transcripción ESR2 en este estudio.
un panel de genes para monitorear el uso de rBST (ab)en ganado lechero
el objetivo final de este trabajo fue proponer un panel rutinario de genes cuyo patrón de transcripción combinado permitiría el desarrollo de un método de cribado para controlar el mal uso de rbST en granjas lecheras a través de MSCs., A diferencia de otros estudios anteriores27,31,32, este trabajo analizó los patrones de transcripción de genes relacionados con rbST en un experimento de condiciones reales de 8 meses que incluyó 12 ciclos de administración de rBST y animales de control. Este enfoque permitió obtener datos más precisos para diferenciar entre las vacas tratadas con rbST y las vacas control.
se realizó un análisis estadístico multivariado para elucidar las modificaciones en los patrones de transcripción de las CMM como consecuencia de la administración de rbST., Para este propósito, solo se utilizó la transcripción de los nueve genes que se midieron con éxito durante todo el experimento (IGF1R, CCND1, TNF, IL1ß, SIRT2, EEFG1, MFEG8, LTF, TDP52L2), excluyendo aquellos genes que solo se expresaron en muy pocos casos/muestras. El objetivo principal del análisis de PCA es identificar patrones globales en los datos, detectando la correlación entre diferentes variables, es decir, en este caso particular, transcripciones de diferentes genes., La proyección de las muestras en el nuevo espacio multidimensional de los componentes principales (PCs) permitiría potencialmente una diferenciación entre rBST y grupos control, destacando también aquellos genes con mayor capacidad como biomarcadores del tratamiento. En la gráfica de puntuación del análisis de PCA mostrada en la Fig. 5, se pudo vislumbrar una tendencia de agrupamiento en los dos grupos de muestras MSC, con animales tratados con rbST identificados como círculos rojos y animales de control como cajas negras, y etiquetados de acuerdo con el día experimental., Varias muestras del grupo rbST aparecieron mezcladas con controles en el lado izquierdo de la parcela pero, curiosamente, la mayoría de ellas corresponden a un día de administración de somatotropina (días 14, 28, 57 u 84) o a los primeros 2-3 días después de una dosis (días 2, 3, 17, 44 o 115), en los que no se detectó una alteración transcriptómica evidente. Por el contrario, muy pocos animales control podrían clasificarse como vacas tratadas en el PCA, y su situación se explica por valores extremos, en particular genes poco discriminativos como LTF, MFGE8 o SIRT2.,
PCA parcela construida mediante completa transcriptómica perfiles de leche de células somáticas (Msc), en el que una discriminación entre las vacas tratadas con rbST (N = 6, círculos rojos) y los animales de control (N = 3; cajas negras) se puede vislumbrar. Las muestras MSC se etiquetan según el día del experimento, siendo el día 0 el día de la primera dosis de rbST en animales tratados.,
los perfiles transcriptómicos también fueron sometidos a un OPLS-DA, del cual también se señalaron genes discriminativos potenciales. En La Fig. 6a, se muestra la representación visual del modelo multivariado, con muestras MSC de animales de control trazadas como cuadrados negros y muestras del grupo rbST como círculos rojos. De manera similar al PCA, varias muestras rbST se proyectan entre las muestras de control en el lado izquierdo de la elipse., Sin embargo, estas muestras se recogieron cuando la alteración transcriptómica causada por rbST había desaparecido (o aún no había aparecido), de manera tan estricta que podían clasificarse como controles en ese momento específico. Por el contrario, muy pocas muestras de control se clasificaron erróneamente como rbST. Cuando no se dispone de un conjunto de pruebas como en este caso, el método de validación cruzada es la principal estrategia para evaluar la calidad de un modelo. Los resultados del procedimiento de validación cruzada se resumen por el valor de los diferentes parámetros de calidad., En este estudio, el modelo multivariado OPLS mostró las siguientes características: R2(X) = 0,6, R2 (y) = 0,4 y Q2 = 0,3. El modelo explica el 60% de la variación en el espacio x y el 40% de la variación en el espacio y, y la bondad de predicción es del 30%. Estos valores indican una descripción relativamente buena de los datos por el modelo y la predictibilidad promedia34. El valor de p calculado a partir del CV-ANOVA fue de 3,01 × 10-7, sugiriendo la existencia de diferencias significativas entre las dos clases del modelo., El hecho de que este modelo fue construido con un panel de genes con diferente capacidad discriminadora no debe ser ignorado, ya que afecta el poder discriminador de los OPLS. Además, esos días experimentales con muy poco o ningún efecto rbST en sus transcripciones definitivamente están sesgando el modelo ya que en la práctica pertenecen a un grupo pero actúan como el otro., En futuros modelos de cribado multivariado, se debe utilizar un panel de genes altamente discriminativos seleccionados, y preferiblemente, las muestras» conocidas «y» desconocidas » que se proyectarán en el modelo multivariado pertenecerán a poblaciones similares (edad, raza, etc.).) y los momentos de lactancia, en un intento de superar la variabilidad interindividual animal35. En este tipo de enfoques, también es importante que la población predictiva sea mayor que las muestras predichas. Finalmente, las razones de discriminación en el OPLS-DA fueron investigadas en el correspondiente s-plot (Fig., 6b), que reveló la contribución de cada variable (transcripción génica) a la separación de las dos clases de muestra. Como se comentó en secciones anteriores, la transcripción más discriminante en MSC se encontró en los genes CCND1, IGF-1R, TNF e IL-1β. Parece claro que los tratamientos rbST desencadenan una regulación ascendente de esos genes y su uso en futuros paneles de monitoreo es una opción prometedora para el control rutinario en lácteos.,
diagrama de dispersión OPLS-DA (a) construido utilizando perfiles trasncriptómicos de células somáticas de leche, mostrando una discriminación entre el control (N = 3; círculos negros) y rBST (n = 6; puntos rojos) animales, etiquetados según el día experimental (siendo el día 0 el día de la 1a dosis en el grupo rBST). S-plot (b) asociado al análisis discriminante OPLS, destacando los genes más afectados por rbST en la esquina superior derecha de la gráfica, y por lo tanto con un mayor poder discriminativo.,
Al igual que en un control rutinario para detectar el uso ilícito de rbST con este panel genético, no habría información sobre cuándo se han tratado las vacas (en otras palabras, es un ensayo ciego), idealmente se debe muestrear/controlar todos los días durante la lactancia. Sin embargo, desde un punto de vista práctico, esta sugerencia suena un poco poco realista. Lo que se propone es una recolección aleatoria de leche Una vez por semana, alternando los días de la semana., Como la somatotropina se administra de forma regular durante toda la lactancia (comenzando 80-100 días después del parto, dos veces por semana), en todas las vacas lactantes de la granja, con un buen plan de muestreo, en algún momento se debe detectar rbST en la granja. Los datos transcriptómicos obtenidos de las muestras recogidas deben compararse con un conjunto de datos transcriptómicos de una población control. Aquellas muestras que presentaron valores más altos de genes propuestos en este trabajo deben ser consideradas sospechosas. El segundo paso debe ser investigar la situación particular de cada vaca» positiva » (mastitis, embarazo, etc.).,), y, si es necesario, continuar con el análisis confirmatorio. Es importante destacar también las capacidades de alto rendimiento de este enfoque de PCR en tiempo real, haciendo factible el plan de muestreo.
