Good Mood

Johdanto

Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on nopeasti laajentunut kliinisen asetus haemato-onkologia ja onkologian, koska se voi tuoda suuria etuja diagnoosi -, valinta -, hoito-ja/tai ennustus monille potilaille (1)., Äskettäin, useita artikkeleita validointi syvä kohdistettu NGS kliinisen onkologian julkaistiin (2, 3), mukaan lukien kattava suositus Association for Molecular Pathology ja College of American Patologi (1). Kohdennettujen NGS-menetelmien standardoinnin puute rajoittaa kuitenkin edelleen niiden täytäntöönpanoa kliinisessä käytännössä (4).

Yksi haaste erityisesti on oikea havaitseminen mutaatioita läsnä matala variantti alleeli taajuudet (VAF) ja standardointi sekvensointi kattavuus syvyys (1, 5, 6)., Tämä on erityisen tärkeää, että mutaatiot, jotka ovat kliiniset vaikutukset subclonal taajuuksia (1), kuten tapauksessa TP53-geenin mutaatioita (TP53mut) krooninen lymfaattinen leukemia (KLL) (7, 8). TP53-poikkeavuudet (TP53mut ja/tai kromosomin 17P poisto) ovat voimakkaimpia CLL: n (9) hoitopäätöksiä ohjaavia ennustavia ja ennustavia markkereita., Nykyään, Euroopan Tutkimus-Aloitteen Krooninen Lymfaattinen Leukemia (ERIC) suosittelee havaita TP53mut, jossa havaitsemisraja (LOD) vähintään 10% VAF (10), ja on yhä enemmän näyttöä omistettu kliininen vaikutus pienten TP53 mutaatio subclones KLL (7, 8).

Sanger sekvensointi ja syvä kohdistettu NGS ovat tällä hetkellä tekniikoita eniten käytetty TP53mut analyysi (10) sekä analyysi muut geenit kliinisiä vaikutuksia alhaisissa alleeli taajuuksia., Vaikka Sanger sekvensointi tarjoaa suhteellisen helposti sekvensointi lähestymistapa, se puuttuu herkkyys havaita alaluokkien, koska sen havaitsemisraja on 10-20% mutatoitunut alleelit (10). NGS-pohjainen analyysi on näin saanut näkyvyyttä diagnostisten laboratorioiden havaitseminen somaattisten muunnelmia ja eri tekninen kehitys virhe korjaus strategioita, laskennallisia ja kokeellisia, kehitetään tarkka tunnistaminen matalan tason geneettistä vaihtelua (11)., Siksi osoite merkitystä oikea määrittäminen sekvensointi syvyys diagnostisia NGS, jotta saadaan varma ja toistettavissa havaitseminen, ei vain alhainen VAF variantteja. Lopuksi, me tehdään laimennus kokeilu vahvistaa, että teoreettiset laskelmat, ja olemme lähellä keskustelemalla kokemuksemme diagnostisia havaitseminen TP53mut KLL-potilailla ja uusia näkökulmia siitä NGS standardointi syövän diagnostiikassa.,

Sekvensointi NGS Syvyys ja virhetaso

sekvensointi NGS syvyys vaikuttaa suoraan toistettavuus variantti havaitseminen: mitä suurempi numero linjassa järjestyksessä lukee, sitä suurempi luottamus pohja puhelun tietyssä asennossa, riippumatta siitä, onko pohja puhelu on sama kuin viite pohja tai on mutatoitunut (1). Toisin sanoen, yksilöllinen sekvensointi virhe lukee ovat tilastollisesti merkityksettömiä, kun he ovat vähäisempiä oikein lukee., Näin ollen haluttu kattavuus syvyys olisi määritettävä aiotun LOD-arvon, väärien positiivisten tai väärien negatiivisten tulosten toleranssin ja jaksotuksen virhetason (1, 11) perusteella.

Käyttäen binomijakauman todennäköisyys vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia tietyn virhetason sekä aiottu LOD voidaan laskea, ja kynnys variantti, jossa vaaditaan tiettyä syvyyttä voidaan arvioida (1)., Esimerkiksi, annetaan sekvensointi virhe, korko 1%, mutantti alleeli taakkaa 10%, ja syvyys kattavuus 250 lukee, todennäköisyys havaita 9 tai vähemmän mutatoitunut lukee on, mukaan binomijakauman, 0,01 prosenttia. Näin ollen todennäköisyys havaita 10 tai enemmän muuntunut lukee on 99,99% (100-0.01%), ja kynnys variantti kutsumus voidaan määritellä. Toisin sanoen, kattavuus syvyys 250 kynnyksen vähintään 10 mutatoitunut lukee on 99.,99% todennäköisyys, että 10% mutantti alleeli, kuormitus ei saa hukata, jonka variantti soittaa (vaikka se voidaan havaita eri osa). Näin väärän negatiivisen tuloksen riski minimoidaan huomattavasti. Toisaalta, todennäköisyys väärien positiivisten riippuu pitkälti sekvensointi virhetaso (kuten tarkkuus kaikki mittaukset riippuu signaali-kohina-suhde) (1, 11). Meidän esimerkissämme väärän positiivisen tuloksen todennäköisyys on 0,025%; väärien positiivisten määrä ei kuitenkaan ole vähäpätöinen laskettaessa LOD-arvoa lähelle virhetasoa., Perinteiset luontainen NGS virhe, hinnat vaihtelevat välillä 0,1-1% (Phred laatu pisteet 20-30) (1, 11) riippuen sekvensointialustamme, GC-pitoisuus target-alueiden (12), ja fragmentti pituus, kuten on esitetty Illumina pariksi-end sequencing (13). Näin ollen, havaitseminen variantteja at VAFs <2% vaikuttaa suuri riski väärän positiivisen tuloksen, riippumatta kattavuus syvyys., Se on myös tärkeää mainita, että sekvensointi virhetaso koskee ainoastaan virheitä valmistettu sekvensointi itse ja ei sisällä muita virheitä aikana käyttöön otetut DNA-käsittely ja kirjasto valmistelu, erityisesti aikana vahvistus vaiheet, jotka entisestään lisäävät virhetasoja (1, 11).

Vähintään Sekvensointi Kattavuus Kliinisissä Asetukset

tällä hetkellä ei ole yksimielisyyttä siitä, pienin vaadittu kattavuus hoitopaikassa käyttäen syvä kohdennettuja uudelleenjärjestely, jonka NGS, ja niin jokainen laboratorio on asettaa omat parametrit, jotta voidaan vastata riittävän laadukkaita (1, 5)., Tähän mennessä vain harvat tutkimukset ovat suositeltava minimi kattavuus kriteerit syvä kohdistettu NGS kliinisen onkologian: 500 syvyys kattavuus ja LOD 5% (2), 300-500 syvyys kattavuus ilman uhmaa LOD (3), 250 syvyys ja LOD 5% kynnys säätö 1000 syvyys kattavuus tarvitaan tapauksissa heterogeeninen variantit alhainen kasvain soluihin näytteitä (1), ja 100 syvyys vähintään 10 variantti lukee ja LOD 10% (10)., Mukaan binominal tietojen jakelu, kattavuus syvyys 250 pitäisi todellakin olla riittävästi havaita 5% VAF, joiden kynnys on variantti tukee lukee ≥5 (Kuva 1). Toisaalta, NGS analyysin kattavuus syvyys 100 pitkin kanssa vaatimus vähintään 10 variantti tukee lukee suosittelema ERIC-konsortio (10) olisi aiheuttaa väärän negatiivisen tuloksen 45 prosenttia näytteitä LOD 10%., Vahvista näiden teoreettisten laskelmien, me suorittaa kaksi riippumatonta laimennus kokeiluja arvioida suorituskykyä TP53 NGS analyysi tunnistaa 10% VAF syvyys kattavuus 100 lukee. Todellakin, meidän on havaittu 30% vääriä negatiivisia (5 positiiviset näytteet 7 true-positiivisten näytteiden ja 9 positiiviset näytteet 13 true-positiivisten näytteiden) kaksi erillistä sekvensointi toimii. Valitettavasti väärä negatiivinen kurssi aliarvioidaan usein kohdennetussa uudelleenselvityksessä., Myös tuoreessa tutkimuksessa tutkitaan muun laboratorion tulokset somaattisten variantti havaitseminen VAFs välillä 15 ja 50% 111 laboratorioita, joissa on todettu, LODs 5-15% (6) osoittaa, että suuria virheitä diagnostisia NGS voi syntyä vääriä negatiivisia tuloksia, vaikka näytteitä, joilla on korkea mutaatio kuormia (6). Kolme samanaikaista vääriä positiivisia tuloksia, kaikki vaihtoehdot olivat oikein osoittaa, mutta mischaracterised (6)., Koska laboratoriot eivät ole pyydetty raportoimaan kattavuus syvyys muilla alueilla kuin tunnistaa variantteja (6), emme voi vain olettaa, että alhainen kattavuus tai korkea variantti soittamalla kynnysarvot osaltaan vääriä negatiivisia tuloksia. Nämä tulokset edelleen korostaa tarvetta standardoitu kattavuus syvyys parametrit diagnostisia NGS, ottaen huomioon sekvensointi virheitä sekä määritys-erityisiä virheitä.

Taajuus TP53 Subclonal Mutaatioita KLL Havaita Diagnostisia NGS

jotta voitaisiin arvioida esiintyminen alhainen VAF reaalimaailman asetukset, me tarkistaa meidän kohortin KLL-potilaat tutkitaan TP53mut meidän diagnostisen laboratorion. Tp53mut arvioitiin aiemmin ilmoitetulla tavalla (14, 15). Lyhyesti, TP53 (eksonien 2-10 mukaan lukien 2 bp intronic päällekkäin, 5′ – ja 3’UTR) analysoitiin käyttäen 100 ng gDNA per reaktio., Amplicon-pohjainen kirjastot sekvensoitiin kuin pariksi-end MiSeq (2×151, Illumina), jossa on vähintään tavoitteeksi lukea syvyydessä 5000 x. LOD ja TP53mut perustettiin 1%, ja muunnosten välillä 1-3% oli vahvistanut replikointi. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta Helsingin julistuksen mukaisesti ilmoittautuneilta potilailta, ja tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen komitea.

diagnostinen kohortin 859 KLL-potilailla (huhtikuu 2016–huhtikuuta 2019), 25% (215/859) oli positiivinen TP53mut, ja ne, 52,6 prosenttia (113/215), joka on tehty muunnelmia, joissa VAF 10% tai alhaisempi., Mukaisesti havaintomme, tuoreessa tutkimuksessa (8) kertoi, läsnäolo 63 ja 84% alhainen taakka (Sanger negatiivinen) TP53muts KLL-potilaista aikaan diagnoosi ja hoito, vastaavasti, ja vahvisti kielteistä vaikutusta kokonaiselinaikaan ja TP53muts edellä 1% VAF aikaan hoidon (8).,

Laskin Diagnostisia NGS Asetukset Havaitsemiseen Subclonal Mutaatioita

auttaa laboratorioiden kanssa määrittäminen vähintään asianmukainen kattavuus parametrit, tarjoamme yksinkertainen, käyttäjäystävällinen teoreettinen laskin (ohjelmisto), joka perustuu binomijakauman (Kuva 2) on esitetty Täydentävien Tiedoston. Web (tai desktop) sovellus ja itsenäinen lähdekoodi R ovat saatavilla GitHub: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Käyttämällä tätä laskinta, oikeat parametrit sekvensointi syvyys ja vastaava vähimmäismäärä variantti lukee tietyn sekvensointi virhe hintaan ja on tarkoitettu LOD voidaan helposti määrittää. Lisäksi, käyttäjät voivat myös ottaa huomioon muita virheitä yksinkertaisesti lisäämällä assay-virheet erityisiä sekvensointi virhe tahtiin ja käyttää tätä yleistä virhettä kuin tulo laskin. Esimerkiksi meidän tapauksessa TP53-mutaation analyysi laskimme yleinen virhe ~1.16% näin voimme perustaa meidän pienin kattavuus syvyys vaatimukset 2000, jossa kynnys vähintään 40 lukee 3% VAF.,

Keskustelua

Vaikka diagnostiset NGS on saanut näkyvyyttä kliinisissä arviointi somaattiset mutaatiot syöpä, riittämätön standardointi sekvensointi parametrit edelleen rajoittaa sen täytäntöönpanoa kliinisessä työssä (1), lähinnä variantteja läsnä alhainen alleeli taajuudet (4). Meillä, sen vuoksi, osoitettu teknisen kysymyksen oikein määrittämiseksi sekvensointi syvyys diagnostisia NGS saadakseen luottavainen ja havainnot toistettavissa alhainen VAF variantteja., Erityisesti, me suoriteta teoreettiset laskelmat määrittää optimaalinen syvyys kattavuus haluttu todennäköisyys havaitseminen vaihtoehtoja klo alhainen alleeli taajuuksia, ottaen huomioon sekvensointi virhe tahtiin. Lisäksi vahvistimme nämä teoreettiset laskelmat tekemällä laimennuskokeita. Näiden havaintojen perusteella, suosittelemme, syvyys kattavuus 1,650 tai uudempi (yhdessä kunkin kynnysarvon vähintään 30 mutatoitunut lukee) soita ≥3% vaihtoehdot saavuttaa 99,9%: n todennäköisyys variantti havaitseminen, käyttämällä tavanomainen sekvensointi NGS virhe vain., Vaihtoehdot 1-3% VAF alue voidaan kutsua vain, jos saadaan sekvenssin data on laadukasta (keskimääräinen Q30 > 90%) ja/tai kun vaihtoehdot ovat vahvistaneet lisääntymään tai osittainen menetelmä (1, 11, 16). Tarjoamme myös yksinkertainen, käyttäjäystävällinen teoreettinen laskin (ohjelmisto) auttaa laboratorioita, joissa on ratkaista oikea sekvensointi syvyys ja vastaava vähimmäismäärä variantti lukee ottaen huomioon sekvensointi virhe tahtiin. Yksinkertainen laskin voi auttaa minimoimaan vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia diagnostisia NGS.,

kuitenkin oikeaan sekvensointisyvyyteen vaikuttavat myös määrityskohtaiset tekijät (1). Virheitä voi esiintyä monissa vaiheissa DNA-käsittelyn ja kirjaston valmistelun aikana. Yleisimpiä ovat NGS: n kirjastovalmistelussa käyttöön otetut vahvistusvirheet (1, 12, 17). Muut yleiset virheiden lähteet liittyvät kirjaston monimutkaisuuteen (analysoitujen riippumattomien DNA-molekyylien määrä), DNA: n laatuun ja kohdealueen monimutkaisuuteen jne. Kaikki mahdolliset määrityskohtaiset virheet olisi korjattava testisuunnittelulla, menetelmän validoinnilla ja laadunvalvonnalla.,

tällä Hetkellä kehittyvien virhe korjaus strategioita, laskennallisia ja kokeellisia, kehitetään lieventämiseksi korkea virhetaso diagnostisia NGS (11). Toistaiseksi, kaikkein lupaava virhe korjaus menetelmiä ovat UMI (Ainutlaatuinen Molekyyli-Tunnisteet), jotka oikea PCR-virheitä (18), ja signaali-kohina korjaus lähestymistapoja (11). Nämä ennakot yritys vähentää LOD, mikä lisää sekvensointi tarkkuutta tarvitaan tulevaisuuden mahdollisuuksia NGS diagnoosi.,

parantamiseksi standardointi diagnostisia NGS, arvio oikea kattavuus syvyys on suositeltava lähtökohta arvioitaessa kynnysarvojen ympäröivän erityisesti NGS-testillä. Kuitenkin, on edelleen puute julkaissut ohjeet, jotka koskevat tekniset vähimmäisvaatimukset ja sen raportointi NGS, erityisen tärkeää havaitseminen klonaalinen ja subclonal mutaatioita syövän diagnostiikassa., Tämä johtuu pääasiassa laaja valikoima kirjaston valmistelu lähestymistapoja, ja lukuisia muuttujia pelissä rooli kussakin NGS pitoisuus, joita on vaikea standardoida, yhdessä laboratorioiden välinen vaihtelu. Sen vuoksi teknisten vähimmäisvaatimusten määrittely ja raportointi kansallisissa TALLETUSSUOJAJÄRJESTELMISSÄ on erittäin toivottavaa., Perustuu meidän kokemus diagnostisia NGS vuonna haemato-onkologia, suosittelemme, ilmoittaa vähintään seuraavat tekniset parametrit: LOD, yleinen virhe NGS assay (tai ainakin sekvensointi virheiden määrä), määrä DNA-tulo -, lähde -, ja laatu DNA -, minimi kattavuus syvyys ja prosenttiosuus kohdennettuja emäkset sekvensoitiin tällä pienin syvyys, kokonaismäärä kohde lukee variantti, joka kattaa alueen ja määrä lukee tukemalla variantti. Erityistä huomiota olisi kiinnitettävä NGS-standardointiin formaliini-kiinteä parafiini-upotettu (FFPE) näytteitä (19, 20).,

yhdessä tutkimuksessa korostetaan, että on tärkeää oikea sekvensointi syvyys ja vähimmäismäärä lukee tarvitaan luotettavia ja toistettavissa havaitseminen variantteja, joilla on alhainen VAF diagnostisia NGS. Laskettaessa oikea sekvensointi syvyys tietyn virhetaso käyttämällä käyttäjäystävällinen teoreettinen laskin (ohjelmisto) voi vähentää vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia diagnostinen NGS, tilanteissa, jotka liittyvät subclonal mutaatiot mm., Tiukka testaus-ja standardoitu vähimmäisvaatimukset diagnostisia NGS on erityisen suotavaa varmistaa oikeat tulokset kliinisissä asetukset.

Tietojen Saatavuus

aineistot luotu tätä tutkimusta varten ovat saatavilla kohtuullista pyyntöä vastaava kirjoittaja.

Kirjailijapanokset

AP ja EK suunnittelivat tutkimuksen, tulkitsivat tulokset ja kirjoittivat käsikirjoituksen. Ap, LS, TD ja PS suorittivat NGS-analyysin. TP keräsi potilasnäytteet ja kliiniset tiedot. MV teki bioinformatiikan analyysin ja kirjoitti laskukoodin. TN valmis Web-sovellus., Kaikki kirjoittajat lukivat ja hyväksyivät käsikirjoituksen lopullisen version.

Rahoitus

tukea: CO CR VES16-32339A, osittain MH CZ—DRO (FNOl, 00098892).

eturistiriita Lausunto

kirjoittajat ilmoittavat, että tutkimus on tehty ilman mitään kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdollisia eturistiriitoja.

Kiitokset

pahoittelemme monta kirjoittajaa, joiden artikkelit voivat ei olla mainittu, koska viiterajat.,

Supplementary Material