Good Mood

Tulokset ja Keskustelu

Arabidopsis cDNA-kirjasto seulottiin käyttämällä 35S-merkitty CaM-sitova seulontaan, kuten on kuvattu (24). Yksi positiivisista klooneista osoitti atcat3: n kanssa identtisen nukleotidijakson tietokannassa (GenBank accession no. U43147). Osoittaakseen, että AtCat3 koodasi CaM-sitovan proteiinin, AtCat3: n koko koodausalue luokiteltiin pET14b-lausekkeen vektoriksi. Rekombinantti AtCat3 indusoitiin isopropyyli-β-d-tiogalaktosidilla (IPTG) (Kuva., 1a) ja puhdistettiin cam-affiniteettikromatografialla lähes homogeeniseksi. Kokonaisbakteeriuutetta käytettiin CaM-sidontatestiin, ja osoitettiin, että 35s-merkitty CaM sitoutuu Atcat3-proteiiniin Ca2+: n läsnä ollessa (Kuva. 1 A). EGTA: n lisäämisen jälkeen CaM-sidosta ei havaittu. Lisäksi, 35S-merkitty CaM ei sitoudu AtCat3 kun CaCl2 oli korvattu muut kaksiarvoiset kationit, kuten MgCl2 tai MnCl2 (Fig. 1a), mikä viittaa siihen, että CaM sitoutuu AtCat3: een, on Ca2+-riippuvainen.

tunnistaa CaM-sitova alue AtCat3, kaksi C-terminaali poistetaan mutantteja käytettiin 35S-CaM-sitovia määrityksiä. Läsnä 0.,2 mM Ca2+, CaM sitoutuu villiin tyyppiin ja mutanttiin 1-451, kun taas CaM ei sitoutunut mutanttiin 1-414(Kuva. 1B), mikä viittaa siihen, että Atcat3: n CaM-sidosalue rajoittuu aminohappoihin 415-451. Edelleen vahvistaa CaM sitova AtCat3, synteettinen peptidi, joka vastaa aminohappoja 415-451 ja AtCat3 inkuboitiin kanssa CaM. Peptidikamerakompleksin muodostumista arvioi nondenaturing PAGE. 36-mer-peptidi pystyy muodostamaan stabiilin kompleksin CaM: n kanssa Ca2+: n läsnä ollessa (Kuva. 1C). Peptidin puuttuessa havaittiin yksi CaM-yhtye., Koska peptidi pitoisuus kasvoi, toisen bändin kanssa alhainen liikkuvuus ilmestyi, eli peptidi-CaM monimutkainen. Kun moolisuhde välillä peptidi ja CaM oli 1:1, vain peptidi-CaM monimutkainen bändi oli havaita, mikä osoittaa, että on vain yksi CaM-sitova sivusto peptidi. Egta: n (Fig. 1C). Nämä tulokset osoittavat, että CaM sitoutuu erityisesti atcat3: een kalsiumista riippuvaisella tavalla.

katalaasia esiintyy lähes kaikissa aerobisissa organismeissa. Eläimillä on vain yksi yhden geenin koodaama katalaasi-isoformi., Sen sijaan kasveissa katalaasia esiintyy useina pienen geeniperheen koodaamina isoformeina (6, 26). Ainakin tämä on totta yksisirkkaisten, kuten maissin ja kaksisirkkaisten, kuten tupakan, Arabidopsis, ja kurpitsa, jossa katalaasi on hyvin ominaista. Mielenkiintoista on, että jokaisella niistä on kolme isoformia, jotka on koodattu kolmella geenillä. Onko kaikki catalases on CaM-sitovia alueita, aminohappo-sekvenssit 37 catalases bakteerien, eläinten ja kasvien verrattiin käyttämällä pileuppi ohjelman GCG10 paketti., Aminohappo sekvenssin vertailu paljasti erittäin korkea homologia N-terminaali 384 aa (noin 60% samankaltaisuus ja 50% identity). Kuitenkin, C-terminaali 108 aa, jossa CaM-sitova alue sijaitsee, siellä oli hyvin vähän samankaltaisuutta AtCat3 ja muut nonplant catalases (noin 21% homologia ja 14% identity). Kuitenkin, kaikki kasvi catalases osoitti korkea homologia tässä osa (noin 78% homologia ja 70% identity), erityisesti alueella, joka vastaa CaM-sitova alue AtCat3. Kuva. 2 osoittaa C-terminaalin 108-aa-sekvenssivertailun 13 edustavaa katalaasia., Vaikka aminohappo-sekvenssit ominaista CaM-sitovia proteiineja ei säilytetään CaM-sitova alue, useimmat niistä ovat toisen asteen rakenteellinen ominaisuus, perus amfifiilisten α-helix (27), kuten auxin-säänneltyjen proteiinia ZmSAUR1 (24) ja kasvi kimeerinen Ca2+/CaM-proteiinikinaasi (28). Huomaa, että CaM-sidosalueilla on usein negatiivisesti varautuneita aminohappoja, mutta nettovaraus on positiivinen (16). GCG-ohjelman avulla tehdyn kierteisen pyöräprojektion perusteella määritettiin, että atcat3: n aminohapot 438-451 kykenevät muodostamaan perusampifiilisen α-helixin., On selvää, että kierteisen pyörän toinen puoli on hydrofobinen ja toinen puoli hydrofiilinen nettopositiivisilla varauksilla. Analyysi aminohappo-sekvenssit vastaavat CaM-sitova alue AtCat3 ennusti olemassaolon perus amfifiilisten α-helix joidenkin muiden kasvien catalases. Mielenkiintoista, joukossa kolme katalaasi-isoentsyymejä in maissi, tupakka, Arabidopsis, ja kurpitsa, siellä on ainakin yksi isoentsyymin kanssa amfifiilisten α-kierteisen rakenteen kunkin lajin, esim.,, tobacco1 (aminohappoja 431-444), maize3 (aminohappoja 442-455), ja pumpkin1 (aminohappoja 438-451), sekä Arabidopsis AtCat1 (aminohappoja 438-451). Onko se koskee kaikkia kasvilajeja ei ole selvää, koska rajallinen katalaasi sekvenssit muiden kasvilajien GenBank. Perustuu kiderakenne tiedot bakteeri-ja nisäkäslajien catalases, α-heliksejä ovat tyypillisiä rakenteiden C-terminaalinen osa näistä catalases (29), mutta ei perus amfifiilisten α-helix rakenne on tämän osan mukaan kierteiset pyörän projektio.,

testata, onko CaM sitoutuu puhdistettu katalaasi alkaen planta, tupakka katalaasi oli puhdistettu lehdistä perustuu Durner ja Klessig (10). Puhdistusprosessin viimeisenä vaiheena käytettiin CaM-Sefaroosikolonnia. Yhteenveto katalaasin puhdistusvaiheista, joissa käytetään 1 000 g tupakanlehtiä, esitetään taulukossa 1. Tupakkakatalaasi puhdistettiin lähes homogeeniseksi SDS/Pagen ja hopeavärjäyksen perusteella (Kuva. 3, kaista 1). Katalaasi identiteettiä vahvistettiin Western blotting, jossa mAb vastaan tupakan katalaasi (Fig. 3, kaista 3)., CaM: n sitoutuminen puhdistettuun tupakkakatalaasiin osoitettiin seuraavilla lähestymistavoilla. (i) Tupakkakatalaasin puhdistamiseen käytettiin Sefaroosikolonnia. Hyötykäyttöaste tämä vaihe oli 81% (Taulukko 1), mikä viittaa suurimman osan katalaasi tupakan lehdet on CaM-sitova proteiini. ii) 35S-merkittyä Nokaa käytettiin testaamaan sitoutumista puhdistettuun katalaasiin 0,2 mM CaCl2: n läsnä ollessa (Kuva. 3, kaista 5). Kontrollina käytettiin rekombinanttia AtCat3: a (Kuva. 3, kaistat 2, 4 ja 6). Lisäys 0.,4 mM EGTA poisti CaM-sidoksen, mikä viittaa siihen, että CaM sitoutuu kasvikatalaasiin Ca2+-riippuvaisesti. CaM-sidontatestejä tehtiin myös sen määrittämiseksi, sitoutuuko se sieni -, nauta-tai ihmiskatalaasiin. Tulokset osoittivat, että mikään näistä ei-plantaaseista ei osoittanut CaM-sidontaa (tietoja ei ole esitetty), mikä on sopusoinnussa aminohapposekvenssivertailujen kanssa (kuva. 2).,

Nokka-sitova sivusto tai tiiviisti rinnakkain alueiden muut tunnettu CaM-sitovia proteiineja usein toimivat autoinhibitory tai pseudosubstrate verkkotunnuksia. Tällä alueella säilytetään kohde proteiineja aktiivisessa tilassa ilman Ca2+ – signaali, kuten kasvi-kimeerinen Ca2+/CaM-riippuvainen proteiinikinaasi (30) ja glutamaatti dekarboksylaasin (31). Tutkimuksen merkitys CaM sitova kasvi catalases, katalyyttinen toiminta rekombinantti AtCat3 ja puhdistettu tupakan katalaasi mitattiin läsnäollessa ja ilman CaCl2-ja CaM., Vastaavia kokeita tehtiin myös käyttämällä muita ei-plantaasikatalyyttejä. Kolibakteerin ilmentämä rekombinantti AtCat3 ei osoittanut aktiivisuutta. Samanlaisia tuloksia saatiin toisessa laboratoriossa (Zhixiang Chen, henkilökohtainen tiedonanto). Tämä voi olla seurausta epäonnistumisesta muodostaa oikea rakenne yhdistelmä katalaasi, koska aktiivinen katalaasi on tetramer koostuu neljästä identtinen tai samanlainen alayksikön (6, 10, 26). Sen sijaan, puhdistettu tupakan katalaasi osoitti merkittävää Ca2+/CaM-riippuvainen muutos toiminnan aikana puhdistuksen vaiheet (Taulukko 1)., Ca2+/CaM: n stimulatoriset vaikutukset ovat kussakin vaiheessa noin 2,2-kertaiset lukuun ottamatta näytettä, joka saatiin CaM-Sefaroosikromatografian jälkeen. Se oli suurempi stimulaatio katalaasi toimintaa (2,5-kertainen) mahdollisesti koska poistaminen ei-Ca2+/CaM-sitova katalaasi murto (Taulukko 1). Sitoutumattoman Ca2 + / CaM-katalaasifraktion ominaisaktiivisuus oli 59,6 yksikköä (perusaktiivisuus). Ca2 + / CaM ei kuitenkaan stimuloinut tämän katalaasin fraktion aktiivisuutta (tietoja ei ole esitetty)., Nämä tulokset osoittavat, että Ca2+/CaM pystyy aktivoimaan tupakan katalaasi murto, joka on saatu sen jälkeen, kun CaM-Sepharose kromatografia, joka vastaa CaM-sitovia tuloksia. Voit vertailla vaikutuksia Ca2+/CaM-toimintaan catalases eri lähteistä, suhteellinen aktiivisuus käytettiin, koska siellä on merkittävä ero spesifinen aktiivisuus catalases eri lajeja. Esimerkiksi A. niger katalaasi on spesifinen aktiivisuus 5,7 yksikköä; naudan maksa katalaasi, 51.9 yksikköä; ihmisen punasolujen, 39.5 yksikköä; tupakka katalaasi, 63.,1 yksikköä (ilman Ca2+/CaM). Kuva. 4a osoittaa, että pelkästään CaCl2: lla tai pelkällä CaM: lla ei ollut stimuloivaa vaikutusta tupakkakatalaasin aktiivisuuteen (noin 40% maksimaalisesta aktiivisuudesta). Eroa katalyyttinen aktiivisuus oli havaittu sieni -, naudan -, tai ihmisen catalases läsnä ollessa tai ilman Ca2+, CaM, ja Ca2+/CaM (Fig. 4 A). Korvaamalla CaCl2: n MgCl2: lla tupakkakatalaasiaktiivisuus ei muuttunut merkittävästi CaM: n läsnä ollessa tai sen puuttuessa (tietoja ei ole esitetty)., Edelleen asiakirjan vaikutus Ca2+/CaM-kasvien katalaasi toiminta, 10 µM, on peptidi, joka vastaa AtCat3 CaM-sitova alue (415-451) on lisätty kunkin seoksen. Peptidin lisääminen ei vaikuttanut ei -planttikatalaaseihin. Ca2+/CaM: n stimuloiva vaikutus tupakkakatalaasin aktiivisuuteen kuitenkin poistettiin lisäämällä peptidi (Kuva. 4 A). Lisäksi peptidin inhiboiva vaikutus tupakkakatalaasin aktiivisuuteen riippui peptidin pitoisuudesta (viikuna. 4 B)., Katalaasin aktiivisuus estyi noin 58%, mikä on lähellä katalaasin perusaktiivisuutta. Peptidi ei kuitenkaan vaikuttanut nautakatalaasin aktiivisuuteen kaikilla testatuilla pitoisuuksilla(Kuva. 4 A). Tulokset viittaavat siihen, että Ca2+/CaM-Valmisteella on stimuloiva vaikutus puhdistettuun kasvikatalaasiin, mutta sillä ei ole vaikutusta plantaaseihin.

Se on tiedossa, että katalaasi on hallitseva peroxisomal entsyymi, mutta sitä esiintyy myös mitokondrioissa ja solulimassa (32). Esimerkiksi maissin Cat3, joka saattaa olla Nokka-sitova katalaasi, joka perustuu aminohappo sekvenssin vertailu, on mitokondrioiden proteiineja (33). Tuloksemme (viikunat. 1-4) osoittaa, että CaM sitoutuu kasvien katalaasiin ja säätelee sen toimintaa. Tämän sääntelytoiminnan osoittamiseksi in vivo tutkimme, toimiiko CaM samanaikaisesti katalaasin kanssa kasvien peroksisomeissa., Etiolatoiduista kurpitsan cotyledonin uutteista valmistetut organellit erotettiin sakkaroositiheyssentrifugoimalla. Poistaa saastuminen sytosolisen proteiineja, jotka saattavat olla läsnä ratkaisua tai vain liittyy peroxisomal kalvo, eristetty jonka hän hoidettiin proteinaasi K. tällä tavalla, reseptilääke jonot proteiineja suojattu proteaasi, jonka peroxisomal kalvo eivät ole pilkottu (34, 35). Peroksisomaalisten jakeiden identiteetti todistettiin mittaamalla katalaasin aktiivisuutta (35)., CaM on hyvin conserved kautta kingdoms (13-16), joten teimme Western analyysi anti-human CaM vasta. Kontrollina käytettiin rekombinanttiperunakamera PCM6: ta (Kuva. 5, kaista 3). Mielenkiintoista, bändi koossa samanlainen PCM6 oli läsnä peroxisomal jakeet, mutta intensiteetti oli huomattavasti pienempi verrattuna sytosolisen CaM (Fig. 5). Tulokset osoittavat, että CaM ja katalaasi kolokalisoituvat peroksisomeissa. CaM on pieni hapan proteiini, joka ilmaistaan ensisijaisesti sytoplasmassa., Kasveissa CaM: n on kuitenkin osoitettu esiintyvän useissa organelleissa, kuten tumassa ja kloroplasteissa (36, 37) ja solunulkoisessa matriisissa (38). Myös CaM-säänneltyjä proteiineja on solunulkoisissa matriiseissa, tumassa ja kloroplasteissa (38-40). Se, miten CaM läpäisee kalvon, ei ole selvää. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että kääntämisen jälkeisillä muutoksilla on merkitystä joidenkin nokka-isoformien translokaatiossa. Esimerkiksi petunia CaM-kuten proteiinia, CaM53, liittyy solukalvon kun proteiini on prenyloituja. Jos prenylaatio estyy, CaM53: A esiintyy pääasiassa tumassa (41).,

– meidän tietoon ei ole raportti, joka käsittelee kalsiumin pitoisuus, jonka hän., Perustuu viime modifioitu malli peroksisomi biogenesis, että peroksisomi on peräisin endoplasmakalvosto (ER) avulla preperoxisomal rakkulat (42). Tiedetään, että ER on yksi solunsisäisistä kalsiumaltaista. Näin ollen peroksisomien kalsiumpitoisuus voi olla yhtä suuri kuin ER: ssä. Mittaus reseptilääke jonot kalsium-pitoisuus ja seuranta tahansa yhteys muuttaa kalsiumin pitoisuutta solulimassa ja peroksisomi pitäisi auttaa meitä ymmärtämään paremmin, miten peroxisomal katalaasi on säännelty Ca2+/CaM., Esimerkiksi vapaan kalsiumin pitoisuus voidaan mitata siirtogeenisten kasvien kanssa käyttövalmiiksi aequorin kanssa peroksisomi-targeting signal. Aequorin on kalsium-herkkä luminescent proteiinia, luminesenssi, joka raportoi suoraan kalsiumin muutos (43). Koska peroksisomi on merkittävä organelle, joka poistaa myrkyllisiä ROS, lähinnä H2O2, se on järkevää spekuloida, että peroxisomal katalaasi aktiivisuus pysyy korkeana koko ajan hajota H2O2 in situ nopeaan tahtiin. Sytosolikalsiumin vaihtelut voivat kuitenkin vaikuttaa merkittävästi sytosolikatalaasin aktiivisuuteen., On tärkeää korostaa, että kaikki katalaasit eivät ole CaM-sitovia proteiineja. Siksi lisätutkimukset ovat tarpeen, jotta voidaan puuttua merkitystä Ca2+/CaM valvoa katalaasi toimintaa eri soluelimiin.

Bioottiset ja abioottiset korostaa laukaista Ca2+ tulva, ja lisääntynyt sytosolisen Ca2+ stimuloi H2O2, joka leviää ympäröivään solujen messenger ja aiheuttaa fysiologinen vaste (19, 20). Meidän tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt sytosolisen Ca2+ voi vähentää H2O2 tasot avulla Ca2+/CaM-välitteisen stimulaatio katalaasi toimintaa (Kuva. 4)., Ehdotamme, että lisääntyneellä sytosolisella Ca2+: lla on kaksoisroolit H2O2 homeostaasin säätelyssä (Kuva. 6): (i) positiivinen asetus tuottaa H2O2 suoraan aktivoimalla NADPH-oksidaasi, joka on affiniteetti Ca2+ (22) ja välillisesti tuottaa enemmän NADPH avulla Ca2+/CaM-säänneltyjen NAD kinaasi (23); ja (ii) negatiivinen asetus vähentää H2O2 stimuloimalla katalaasi toiminnan kautta Ca2+/CaM-modulaatio (Fig. 4)., Signaalin aiheuttama muutokset Ca2+ transientit voivat vaihdella taajuus, kesto, amplitudi, ja spatiaalinen lokalisointi heilahtelut, ja tila paikkatietojen lisääminen, joka johtaa differential vaikutukset kalsiumin kohde proteiineja (12, 44).