objectifs
- familiarisez-vous avec la spéciation du genre Staphylococcus.
- cultiver et identifier différentes espèces de staphylocoques en utilisant une gélose sélective et différentielle
- identifier les 3 types hémolytiques sur une gélose sanguine.,
Staphylococcus est un genre de cocci Gram +, Non sporophores appartenant à la famille des Micrococcaceae qui sont souvent trouvés comme microbiote humain normal de la peau et de la cavité nasale. Il y a cinq organismes à considérer comme pathogènes humains potentiels dans ce genre: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophiticus, S. haemolyticus et S. hominis, mais les trois premiers sont les isolats les plus courants. S. aureus est souvent considéré comme le plus problématique des trois agents pathogènes et se distingue des deux autres en étant le seul capable de coaguler le plasma. S., aureusis capable de provoquer de nombreuses infections pyogènes superficielles (formant du pus) du derme et des tissus sous-jacents ainsi que des infections systémiques graves. Il peut produire une gamme de toxines, y compris les entérotoxines (intoxication alimentaire), les cytotoxines (toxines systémiques générales) et les superantigènes de choc toxique. Les autres staphylocoques à coagulase négative (S. epidermidis et S. saprophiticus) sont beaucoup moins fréquemment trouvés comme agents pathogènes, mais sont parfois associés à l’endocardite,aux infections des articulations prothétiques et aux infections des plaies, pour n’en nommer que quelques-uns.,
Cet exercice vous donne la possibilité d’utiliser des milieux sélectifs, dans ce cas à base de chlorure de sodium élevé (MSA et SM1 10 sont tous deux des milieux sélectifs pour l’isolement des staphylocoques – 7,5% de NaCl). Un milieu sélectif a un agent inhibiteur qui favorise la croissance de certaines bactéries en inhibant d’autres. MSA contient un indicateur supplémentaire pour surveiller la fermentation du mannitol, ce qui en fait également un milieu différentiel., Parmi les bactéries qui peuvent se développer en présence de NaCl élevé, certaines sont Halophiles (nécessitant une certaine concentration de sel pour croître) tandis que d’autres sont haloduriques (ne pas utiliser le sel, mais peut le tolérer). Staphylococcus n’est pas halophile, mais plutôt halodurique, en ce sens qu’il peut vivre ou supporter des concentrations élevées de NaCl. La teneur élevée en sel de SM1 10 et de MSA inhibe d’autres microorganismes cutanés courants. Les autres milieux utilisés dans cet exercice servent à différencier le staphylocoque pathogène du staphylocoque non pathogène et à identifier l’espèce.,
non seulement résistant au sel, le staphylocoque est toujours anaérobie facultatif. Lorsqu’il est coloré, il sera vu en petites grappes (staphylo = grappe). Le staphylocoque est généralement bêta-hémolytique ou pas du tout hémolytique (appelée hémolyse gamma). Les staphylocoques pathogènes peuvent produire une variété de facteurs de virulence, y compris les toxines,la coagulase, les leucocidines et les enzymes hydrolytiques qui peuvent endommager les tissus de l’hôte.
La gélose sanguine (BAP) est faite avec 5% de sang de mouton. C’est un milieu commun utilisé pour cultiver des bactéries car:
- c’est un excellent milieu d’enrichissement pour les bactéries exigeantes.,
- L’hémolyse des cellules sanguines peut être très utile comme test d’identification.
La gélose CNA est un type de gélose sanguine. La seule différence est que L’AIIC a un antibiotique, l’acide naladixique, qui inhibe les bactéries gram.
L’hémolyse est la dégradation des globules rouges. Les hémolysines sont des enzymes produites par certaines bactéries et sont libérées dans le milieu autour de la colonie bactérienne. Il peut s’agir d’une dégradation complète des cellules, avec la libération d’hémoglobine et une élimination du rouge du milieu environnant autour de la colonie., Ou l’hémolyse peut être une dégradation partielle, entraînant une zone verdâtre ou vert-jaune autour de la colonie.,i>
schéma de la procédure D’IDENTIFICATION
1ère session après ⇒ 2ème session après ⇒ 3ème session après ⇒ 4ème session
CNA DNAse coagulase exécuter d’autres tests nécessaires identifier les espèces
MSA sm110 onpg
catalase oxydase
gram phénol lactose rouge
bouillon de teinture
les procédures
note
assurez-vous de conserver une liste de tous les résultats des tests pour vos isolats.,
1ère Session
- chaque tableau recevra une espèce staphylococcique poussant sur une plaque aNA ou TSA.
- à l’aide d’une technique de strie d’isolement, inoculer L’acide Naladixique de Columbia (ANC) et placer le disque de novobiocine dans la section 1.
- La sensibilité à la Novobiocine est une caractéristique clé de différenciation chez certaines espèces de staphylocoques. Placez les pinces dans l’alcool, puis stérilisez les pinces en les faisant passer rapidement à travers la flamme. L’alcool prendra feu et une fois évaporé de la pince, ils seront alors stériles., Vous pouvez maintenant choisir un disque de novobiocine du support pour le placer sur la plaque CNA—dans la première section de strie (où il y aura une croissance confluente de la bactérie).
- Pour les autres plaques de gélose SM plaque SM 110, plaque de gélose au sel de mannitol (MSA), plaque de gélose à la DNAse—une ligne d’inoculation au centre de la plaque est adéquate pour les résultats de croissance.
- incuber le milieu à 37°C.
- effectuer des tests d’oxydase et de catalase sur Culture sur plaque.
- tache de Gram l’isolat pour obtenir la forme et l’arrangement aussi bien que la réaction de gram.
- nous ferons le test ONPG la prochaine session., Ce test nécessite l’activation d’un ensemble de gènes, l’opéron lac. Pour induire cette activité, la bactérie doit être exposée au lactose. C’est pourquoi vous allez également inoculer un tube de bouillon de lactose rouge phénol.
2e Session
- aller à des exercices de laboratoire individuels pour interpréter le test du sel de mannitol et de la DNAse (nécessite HCl).
- sur la plaque CNA, vous vérifiez 2 réactions – – – sensibilité à l’antibiotique novobiocine et hémolyse du sang.,
- sensibilité à la Novobiocine – une zone de 17 mm indique une sensibilité
- réactions hémolytiques :
- alpha (α) hémolyse–zone verte autour de la colonie, causée par une fuite d’hémoglobine convertie en biliverdine, appelée hémolyse partielle
- bêta (β) hémolyse–compensation complète autour de la colonie dégradation des RBCs par les enzymes streptolysines
- hémolyse gamma (γ) – pas D’hémolysines, pas de zone
- les espèces de staphylocoques sont soit bêta hémolytiques, soit gamma (pas hémolytiques)., Staph aureus produit de la toxine alpha qui provoque généralement de larges zones d’hémolyse bêta (complète).
- Vérifier le SM 110 pour la croissance et du pigment. Les nutriments et les vitamines dans ce milieu améliorent la pigmentation du staphylocoque pathogène, ces colonies devenant une colonie jaune-orange.
- exécuter le test de coagulase: il y a un exercice lié pour ce test. Il n’y a que quelques espèces de staphylocoques qui sont positives pour le test de coagulase (voir tableau ci-dessous), et S. aureus est le plus commun., Comme il existe 2 types de coagulase liés à l’enzyme et libres—–il existe 2 tests différents qui peuvent être utilisés pour identifier ces enzymes. La méthode du TUBE est le test définitif du 2, le plus fiable. L’exercice de test de coagulase dans le manuel de laboratoire décrit clairement ces 2 versions.
- Le test ONPG sera exécuté. Regardez dans vos exercices de laboratoire pour ce test pour les instructions sur la façon d’effectuer le test. Comme il y a très peu de liquide dans le tube, vous voudrez couvrir le haut du tube Parafilm et ensuite placer le dessus du tube sur cela. Cela réduit la déshydratation.,
3ème Session
- La principale réaction de test à utiliser dans l’identification du staphylocoque est la réaction de test de la coagulase, qui divise le genre Staphylococcus en 2 groupes—les espèces négatives de la coagulase et les espèces positives de la coagulase. Le support de test que vous allez exécuter pour l’identification dépend de la catégorie dans laquelle votre organisme tombe. Vous pouvez exécuter certains tests suivants.,
- Available media:
- arginine and ornithine
- decarboxylase broths
- urea broth
- ONPG
- sucrose, trehalose, maltose sugars
- VP broth
- nitrate broth
- If you have a coagulase positive Staph, there are only a few species available as your choice: there is a table with those species below.,
- Si votre organisme est négatif à la coagulase, consultez l’organigramme ci-dessous, ainsi que le manuel de Bergey ou d’autres livres d’identification.
- exécutez les tests nécessaires pour l’identification. C’EST À VOUS DE DÉTERMINER QUELS TESTS SUPPLÉMENTAIRES EXÉCUTER POUR UNE IDENTIFICATION CLAIRE.
4ème Session
- lisez tous les tests de la dernière session (voir exercices de laboratoire pour plus d’informations sur les interprétations des tests.
- Rédigez un rapport pour l’identification de votre espèce de staphylocoque, si votre instructeur vous le demande.,
| Tube coagulase | Acid from trehalose | VP test | ONPG test | |
| S. aureus | + | + | + | – |
| S. intermedius | + | + | – | + |
| S., hyicus | variable | + | – | – |
| S. schleiferi | + | – | + | ? |
Common coagulase negative Staphylococcal species
| S. aureus | S. epidermidis | S. saprophiticus | |
| Alpha toxin (ß-hemolysis) | + (most strains) | – | – |
| Growth on 7.,acace93570″>DNase production | + (usually) | – | – |
| Sensitivity to novobiocin | sensitive | sensitive | resistant |
* Novobiocin sensitivity = >17mm zone size
QUESTIONS
- Which type of hemolysis is often associated with pathogenicity?,
- quelles sont les caractéristiques distinctives du genre Staphylococcus?
- pouvez-vous donner la réaction de test de S. aureus pour chacun des principaux tests– – MSA, SM110, coagulase, catalase, oxydase et DNAse?
- qu’advient-il des CCR dans l’hémolyse bêta et alpha?
les Contributeurs et les Attributions
-
Jackie Reynolds, un Professeur de Biologie (Richland College)
