Good Mood

Introduction

de séquençage de nouvelle génération (NGS) s’est rapidement développée dans le contexte clinique dans haemato-oncologie et en oncologie, comme il peut apporter de grands avantages pour le diagnostic, le choix du traitement, et/ou de pronostic pour de nombreux patients (1)., Récemment, plusieurs articles sur la validation de NGS ciblés en profondeur en oncologie clinique ont été publiés (2, 3), y compris une recommandation complète de L’Association for Molecular Pathology et du College of American Pathologists (1). Cependant, l’absence de standardisation des méthodes NGS ciblées limite encore leur mise en œuvre dans la pratique clinique (4).

un défi en particulier est la détection correcte des mutations présentes à de faibles fréquences d’allèles variant (VAF) et la standardisation de la profondeur de couverture de séquençage (1, 5, 6)., Ceci est particulièrement important pour les mutations qui ont des impacts cliniques aux fréquences sous-clonales (1) comme le cas des mutations du gène TP53 (TP53mut) dans la leucémie lymphocytaire chronique (LLC) (7, 8). Les aberrations TP53 (TP53mut et/ou délétion du chromosome 17P) sont parmi les marqueurs pronostiques et prédictifs les plus puissants guidant les décisions de traitement dans la LLC (9)., De nos jours, L’initiative européenne de recherche sur la leucémie lymphocytaire chronique (ERIC) recommande de détecter TP53mut avec une limite de détection (LOD) d’au moins 10% de VAF (10), et un nombre croissant de preuves existent dédiées à l’impact clinique des petites sous-clones mutés TP53 dans la LLC (7, 8).

le séquençage Sanger et les NG ciblées en profondeur sont actuellement les techniques les plus utilisées pour L’analyse de TP53mut (10) ainsi que pour l’analyse d’autres gènes ayant des impacts cliniques à faible fréquence d’allèles., Bien que le séquençage Sanger offre une approche de séquençage relativement accessible, il n’a pas la sensibilité nécessaire pour détecter les sous-clones en raison de sa limite de détection de 10 à 20% d’allèles mutés (10). L’analyse basée sur le NGS a ainsi gagné en importance dans les laboratoires de diagnostic pour la détection de variantes somatiques et divers développements techniques de stratégies de correction d’erreur, à la fois informatiques et expérimentales, sont en cours de développement pour l’identification précise des variations génétiques de bas niveau (11)., Nous abordons donc l’importance de la détermination correcte de la profondeur de séquençage dans les NGS diagnostiques afin d’obtenir une détection sûre et reproductible, non seulement des variants VAF faibles. Enfin, nous avons effectué une expérience de dilution pour confirmer nos calculs théoriques, et nous terminons en discutant de notre expérience avec la détection diagnostique de TP53mut chez les patients atteints de LLC et d’autres perspectives sur la standardisation des NGS dans le diagnostic du cancer.,

profondeur de séquençage NGS et taux d’erreur

la profondeur de séquençage NGS affecte directement la reproductibilité de la détection des variantes: plus le nombre de lectures de séquences alignées est élevé, plus la confiance de l’appel de base à une position particulière est élevée, que l’appel de base soit identique à la base de En d’autres termes, les lectures d’erreur de séquençage individuelles sont statistiquement non pertinentes lorsqu’elles sont plus nombreuses que les lectures correctes., Ainsi, la profondeur de couverture souhaitée doit être déterminée en fonction de la LD prévue, de la tolérance pour les résultats faussement positifs ou faussement négatifs et du taux d’erreur de séquençage (1, 11).

en utilisant une distribution binomiale, la probabilité de résultats faussement positifs et faussement négatifs pour un taux d’erreur donné ainsi que la LOD prévue peut être calculée, et le seuil pour une variante appelant une profondeur donnée peut être estimé (1)., Par exemple, étant donné un taux d’erreur de séquençage de 1%, une charge d’allèles mutants de 10% et une profondeur de couverture de 250 lectures, la probabilité de détecter 9 lectures mutées ou moins est, selon la distribution binomiale, de 0,01%. Par conséquent, la probabilité de détecter 10 lectures mutées ou plus est de 99,99% (100-0, 01%), et le seuil pour un appel variant peut être défini. En d’autres termes, une profondeur de couverture de 250 avec un seuil d’au moins 10 lectures mutées aura un 99.,99% de probabilité que 10% de la charge de l’allèle mutant ne soit pas manquée par l’appel variant (bien qu’il puisse être détecté dans une proportion différente). De cette façon, le risque d’un résultat faussement négatif est grandement minimisé. D’autre part, la probabilité de faux positifs dépend fortement du taux d’erreur de séquençage (car la précision de toutes les mesures analytiques dépend du rapport signal / bruit) (1, 11). Dans notre exemple, la probabilité d’un résultat faussement positif est de 0,025%; cependant, le taux de faux positifs n’est pas négligeable lorsqu’on diminue le LOD à la valeur proche du taux d’erreur., Les taux d’erreur intrinsèques NGS classiques varient entre 0,1 et 1% (score de qualité Phred de 20-30) (1, 11) en fonction de la plate-forme de séquençage, de la teneur en GC des régions cibles (12) et de la longueur du fragment, comme indiqué dans le séquençage D’extrémité appariée Illumina (13). Par conséquent, la détection de variants à VAFs <2% est affectée par un risque élevé de résultat faussement positif, quelle que soit la profondeur de couverture., Il est également important de mentionner que le taux d’erreur de séquençage s’applique uniquement aux erreurs produites par le séquençage lui-même et n’inclut pas les autres erreurs introduites lors du traitement de L’ADN et de la préparation de la bibliothèque, en particulier lors des étapes d’amplification, qui augmentent encore les taux d’erreur (1, 11).

couverture minimale de séquençage en milieu clinique

Il n’y a actuellement aucun consensus sur la couverture minimale requise en milieu clinique en utilisant un reséquençage ciblé en profondeur par NGS, et chaque laboratoire doit donc définir ses propres paramètres afin d’atteindre une qualité suffisante (1, 5)., À ce jour, seules quelques études ont recommandé les critères de couverture minimale pour les NG ciblées en profondeur en oncologie clinique: 500 profondeur de couverture et une LOD de 5% (2), 300-500 profondeur de couverture sans défier la LOD (3), 250 profondeur et une LOD de 5% avec ajustement du seuil à 1 000 profondeur de couverture est nécessaire dans les cas de variants hétérogènes dans les échantillons de cellularité tumorale faible (1), et 100 profondeur avec au moins 10 lectures de variantes et une LOD de 10% (10)., Selon la distribution binominale des données, une profondeur de couverture de 250 devrait en effet être suffisante pour détecter 5% de VAF avec un seuil de variant supportant des lectures ≥5 (Figure 1). D’autre part, une analyse NGS avec une profondeur de couverture de 100 avec une exigence d’au moins 10 variantes supportant des lectures comme recommandé par le consortium ERIC (10) entraînerait un faux négatif de 45% pour les échantillons avec une LOD de 10%., Pour confirmer ces calculs théoriques, nous avons effectué deux expériences de dilution indépendantes pour estimer la performance de L’analyse TP53 NGS pour détecter 10% de VAF à une profondeur de couverture de 100 lectures. En effet, nous avons détecté 30% de faux négatifs (5 échantillons positifs de 7 échantillons vrais-positifs et 9 échantillons positifs de 13 échantillons vrais-positifs) dans deux séries de séquençage indépendantes. Malheureusement, le taux de faux négatifs est souvent sous-estimé dans le reséquençage ciblé., En outre, une étude récente portant sur les résultats inter-laboratoires de détection de variantes somatiques avec des VAF compris entre 15 et 50% dans 111 laboratoires avec des Lod déclarés de 5 à 15% (6) montre que des erreurs majeures dans les NG diagnostiques peuvent résulter de résultats faussement négatifs, même dans des échantillons avec des charges de mutation élevées (6). Sur trois résultats faussement positifs simultanés, tous les variants ont été correctement détectés mais mal caractérisés (6)., Étant donné qu’on n’a pas demandé aux laboratoires de déclarer la profondeur de couverture pour d’autres régions que les variantes identifiées (6), Nous pouvons seulement supposer que des seuils de couverture faible ou élevés ont contribué aux résultats faussement négatifs. Ces résultats soulignent en outre le besoin de paramètres normalisés de profondeur de couverture dans les NG de diagnostic, en tenant compte des erreurs de séquençage ainsi que des erreurs spécifiques aux tests.

fréquence des Mutations sous-clonales de TP53 dans la LLC détectées par le NGS diagnostique

afin d’évaluer l’apparition d’un faible VAF dans le monde réel, nous avons examiné notre cohorte de patients atteints de LLC examinés pour TP53mut dans notre laboratoire de diagnostic. Les TP53mut ont été évalués comme indiqué précédemment (14, 15). En bref, TP53 (exons 2-10 incluant Chevauchement intronique de 2 bp, 5′ et 3’UTR) a été analysé en utilisant 100 ng gDNA par réaction., Les bibliothèques basées sur Amplicon ont été séquencées en tant qu’extrémité appariée sur MiSeq (2×151, Illumina) avec des profondeurs de lecture cibles minimales de 5 000 X. La LOD de TP53mut a été configurée à 1%, et les variantes comprises entre 1 et 3% ont été confirmées par réplication. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients inscrits conformément à la déclaration D’Helsinki, et l’étude a été approuvée par le Comité d’éthique local.

de la cohorte diagnostique de 859 patients atteints de LLC (avril 2016–avril 2019), 25% (215/859) étaient positifs pour TP53mut, et parmi ceux-ci, 52,6% (113/215) portaient des variantes avec VAF à 10% ou moins., Conformément à nos observations, une étude récente (8) a rapporté la présence de 63 et 84% de TP53muts à faible charge (Sanger négatif) chez les patients atteints de LLC au moment du diagnostic et au moment du traitement, respectivement, et a confirmé l’impact négatif sur la survie globale de TP53muts au-dessus de 1% VAF au moment du traitement (8).,

calculateur pour les paramètres diagnostiques NGS pour la détection des Mutations sous-clonales

pour aider les laboratoires à déterminer les paramètres minimaux de couverture appropriés, nous fournissons un calculateur théorique (logiciel) simple et convivial basé sur la distribution binomiale (Figure 2), décrite dans le fichier supplémentaire. Une application web (ou de bureau) et des codes source autonomes dans R sont accessibles sur Github: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., En utilisant ce calculateur, les paramètres corrects de la profondeur de séquençage et le nombre minimum correspondant de lectures de variantes pour un taux d’erreur de séquençage donné et Lod prévu peuvent facilement être déterminés. De plus, les utilisateurs peuvent également prendre en compte d’autres erreurs en ajoutant simplement des erreurs spécifiques au test au taux d’erreur de séquençage et en utilisant cette erreur globale comme entrée dans la calculatrice. Par exemple, dans notre cas D’analyse mutationnelle TP53, nous avons calculé avec l’erreur globale de ~1,16%, nous avons donc défini nos exigences de profondeur de couverture minimale à 2 000 avec un seuil de 40 lectures minimum pour 3% VAF.,

Discussion

bien que le NGS diagnostique ait gagné en importance en milieu clinique pour l’évaluation des mutations somatiques dans le cancer, une standardisation insuffisante des paramètres de séquençage limite encore sa mise en œuvre en pratique clinique (1), principalement pour les variants présents à de faibles fréquences d’allèles (4). Nous avons donc abordé la question technique de la détermination correcte de la profondeur de séquençage dans les NGS diagnostiques afin d’obtenir des détections sûres et reproductibles de variants VAF faibles., En particulier, nous avons effectué des calculs théoriques pour déterminer la profondeur de couverture optimale pour la probabilité souhaitée de détection de variants à basses fréquences d’allèles, en tenant compte du taux d’erreur de séquençage. De plus, nous avons confirmé ces calculs théoriques en effectuant des expériences de dilution. Sur la base de ces observations, nous recommandons une profondeur de couverture de 1 650 ou plus (avec le seuil respectif d’au moins 30 lectures mutées) pour appeler ≥3% de variants afin d’obtenir une probabilité de détection de variants de 99,9%, en utilisant uniquement l’erreur de séquençage NGS classique., Les Variants dans la plage VAF 1-3% ne peuvent être appelés que si les données de séquence obtenues sont de haute qualité (Q30 moyen > 90%) et/ou lorsque les variants sont confirmés par la réplication ou la méthode orthogonale (1, 11, 16). Nous fournissons également un calculateur théorique (logiciel) simple et convivial pour aider les laboratoires à résoudre la profondeur de séquençage correcte et le nombre minimum correspondant de lectures de variantes tout en tenant compte du taux d’erreur de séquençage. Notre calculatrice simple peut aider à minimiser les résultats faux positifs et faux négatifs dans les NGS de diagnostic.,

néanmoins, la profondeur de séquençage correcte est également influencée par des facteurs spécifiques au test (1). Des erreurs peuvent survenir à plusieurs étapes du traitement de l’ADN et de la préparation de la bibliothèque. Les plus courantes sont les erreurs d’amplification introduites lors de la préparation de la bibliothèque NGS (1, 12, 17). D’autres sources courantes d’erreurs concernent la complexité de la bibliothèque (le nombre de molécules d’ADN indépendantes analysées), la qualité de l’ADN et la complexité de la région cible, etc. Toutes les erreurs potentielles propres à l’essai doivent être corrigées au moyen de la conception de l’essai, de la validation de la méthode et du contrôle de la qualité.,

actuellement, de nouvelles stratégies de correction des erreurs, à la fois computationnelles et expérimentales, sont en cours d’élaboration afin d’atténuer les taux d’erreur élevés dans les end diagnostiques (11). JUSQU’à présent, parmi les méthodes de correction d’erreur les plus prometteuses figurent les UMI (identificateurs moléculaires uniques), qui corrigent les erreurs de PCR (18), et les approches de correction signal sur bruit (11). Ces avancées tentent de réduire la LD, augmentant ainsi la précision du séquençage nécessaire pour les opportunités futures dans le diagnostic NGS.,

afin d’améliorer la normalisation dans le diagnostic NGS, l’estimation de la profondeur de couverture correcte est un point de départ recommandé lors de l’évaluation des seuils entourant un test NGS particulier. Néanmoins, il y a encore un manque de directives publiées concernant les exigences techniques minimales et leur déclaration dans NGS, particulièrement important dans la détection des mutations clonales et subclonales dans le diagnostic du cancer., Cela est principalement dû au large éventail d’approches de préparation en bibliothèque et aux nombreuses variables jouant un rôle dans chaque test NGS spécifique, qui sont difficiles à normaliser, ainsi qu’à la variabilité inter-laboratoires. Par conséquent, la définition des exigences techniques minimales et leur déclaration dans NGS est hautement souhaitable., Sur la base de notre expérience en NGS diagnostique en hémato-oncologie, nous suggérons de signaler au moins les paramètres techniques suivants: LOD, erreur globale du test NGS (ou au moins taux d’erreur de séquençage), quantité D’ADN entrant, source et qualité de L’ADN, profondeur de couverture minimale et pourcentage de bases ciblées séquencées à cette profondeur minimale, nombre total de lectures cibles couvrant la région de la variante et nombre de lectures supportant la variante. Un accent particulier devrait être mis sur la normalisation NGS des échantillons de paraffine incorporée au formol (FFPE) (19, 20).,

ensemble, notre étude met en évidence l’importance d’une profondeur de séquençage correcte et du nombre minimum de lectures requis pour une détection fiable et reproductible des variants à faible VAF dans les NGS diagnostiques. Le calcul de la profondeur de séquençage correcte pour un taux d’erreur donné à l’aide de notre calculatrice théorique conviviale (logiciel) peut aider à minimiser les résultats faux positifs et faux négatifs dans les NGS diagnostiques, dans des situations liées à des mutations sous-clonales entre autres., Les tests rigoureux et les exigences minimales normalisées pour les end diagnostiques sont particulièrement souhaitables pour assurer des résultats corrects en milieu clinique.

disponibilité des données

Les ensembles de données générés pour cette étude sont disponibles sur demande raisonnable à l’auteur correspondant.

contributions des auteurs

AP et EK ont conçu l’étude, interprété les résultats et écrit le manuscrit. AP, LS, TD et PS ont effectué une analyse NGS. TP a recueilli les échantillons de patients et les données cliniques. MV a effectué une analyse bioinformatique et a écrit le code de la calculatrice. Application web préparée par TN., Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit.

Financement

subvention: MZ CR VES16-32339a, en partie par le MH CZ—DRO (FNOl, 00098892).

déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Nous nous excusons auprès des nombreux auteurs dont les articles n’ont pas pu être cités en raison des limites de référence.,

Supplementary Material