Good Mood

résultats et Discussion

la bibliothèque D’ADNc D’Arabidopsis a été criblée à l’aide de l’approche de criblage de liaison CaM marquée au 35S décrite (24). Un des clones positifs a montré une séquence nucléotidique identique à AtCat3 dans la base de données (GenBank accession no. U43147). Pour prouver Qu’AtCat3 a codé une protéine de liaison CaM, la région codante complète D’AtCat3 a été sous-clonée dans le vecteur d’expression pET14b. L’AtCat3 recombinant a été induit par l’isopropyle β-D-thiogalactoside (IPTG) (Fig., 1A) et a été purifié par chromatographie D’affinité CaM à une homogénéité proche. L’extrait bactérien total a été utilisé pour le test de liaison à la CaM, et il a été montré que la CaM marquée au 35S se lie à la protéine AtCat3 en présence de Ca2+ (Fig. 1A). Après l’ajout D’EGTA, aucune liaison CaM n’a été observée. De plus, les CaM marquées au 35S ne se liaient pas à AtCat3 lorsque CaCl2 était remplacé par d’autres cations divalents tels que MgCl2 ou MnCl2 (Fig. 1A), suggérant que la liaison CaM à AtCat3 dépend du Ca2+.

pour identifier la zone de liaison CaM dans AtCat3, deux mutants de délétion C-terminale ont été utilisés pour des essais de liaison CaM 35S. En présence de 0.,2 mM Ca2+, CaM se lie au type sauvage et au mutant 1-451, alors que CaM ne se lie pas au mutant 1-414 (Fig. 1B), suggérant que la région de liaison CaM pour AtCat3 est limitée aux acides aminés 415-451. Pour confirmer davantage la liaison de la CaM à L’AtCat3, un peptide synthétique correspondant aux acides aminés 415-451 de L’AtCat3 a été incubé avec de la CaM. La formation du complexe peptide-CaM a été évaluée par PAGE Non dénaturante. Le peptide 36-mer est capable de former un complexe stable avec CaM en présence de Ca2 + (Fig. 1C). En l’absence de peptide, une seule bande CaM a été observée., Au fur et à mesure que la concentration en peptides augmentait, une autre bande à faible mobilité est apparue, représentant le complexe peptide-CaM. Lorsque le rapport molaire entre le peptide et la CaM était de 1:1, seule la bande complexe peptide-CaM a été détectée, indiquant qu’il n’y a qu’un seul site de liaison à la CaM dans le peptide. Aucun complexe peptidique-CaM n’a été formé en présence D’EGTA (Fig. 1C). Ces résultats indiquent que CaM se lie spécifiquement à L’AtCat3 d’une manière dépendante du calcium.

la Catalase existe dans presque tous les organismes aérobies. Chez les animaux, il n’y a qu’une seule isoforme de catalase codée par un seul gène., En revanche, la catalase chez les plantes est présente sous forme d’isoformes multiples codées par une petite famille de gènes (6, 26). Au moins, cela est vrai dans les monocotylédones telles que le maïs et les dicotylédones telles que le tabac, L’Arabidopsis et la citrouille, dans lesquelles la catalase est bien caractérisée. Fait intéressant, chacun d’eux a trois isoformes codées par trois gènes. Pour déterminer si toutes les catalases ont les régions de liaison CaM, les séquences d’acides aminés de 37 catalases provenant de bactéries, d’animaux et de plantes ont été comparées à l’aide du programme pileup dans le package GCG10., La comparaison des séquences d’acides aminés a révélé une homologie très élevée dans le N-terminal 384 aa (environ 60% de similarité et 50% d’identité). Cependant, dans le C-terminal 108 aa, où se trouve la région de liaison CaM, il y avait très peu de similitude entre AtCat3 et d’autres catalases Non végétales (environ 21% d’homologie et 14% d’identité). Néanmoins, toutes les catalases végétales ont montré une homologie élevée dans cette portion (environ 78% d’homologie et 70% d’identité), en particulier dans la région correspondant à la zone de liaison CaM dans AtCat3. Figue. La figure 2 montre la comparaison de séquences C-terminal 108-aa de 13 catalases représentatives., Bien que les séquences d’acides aminés dans les protéines de liaison CaM caractérisées ne soient pas conservées dans la région de liaison CaM, la plupart d’entre elles présentent une caractéristique structurelle secondaire, l’hélice α amphiphile basique (27), telle que la protéine régulée par l’auxine ZmSAUR1 (24) et la protéine kinase chimérique végétale Ca2+/CaM (28). Notez qu’il y a souvent des acides aminés chargés négativement dans les régions de liaison CaM, mais la charge nette est positive (16). Sur la base de la projection de roue hélicoïdale utilisant le programme GCG, il a été déterminé que les acides aminés 438-451 dans AtCat3 sont capables de former une hélice α amphiphile basique., Il est clair qu’un côté de la roue hélicoïdale est hydrophobe et l’autre côté est hydrophile avec des charges positives nettes. L’analyse des séquences d’acides aminés correspondant à la région de liaison CaM D’AtCat3 a prédit l’existence d’une hélice α amphiphile basique dans certaines des autres catalases végétales. Fait intéressant, parmi trois isoformes de catalase dans le maïs, le tabac, L’Arabidopsis et la citrouille, il y a au moins une isoforme avec la structure α-hélicoïdale amphiphile dans chaque espèce, par exemple,, tabaco1 (acides aminés 431-444), maize3 (acides aminés 442-455), et pumpkin1 (acides aminés 438-451), ainsi que Arabidopsis AtCat1 (acides aminés 438-451). Il n’est pas clair si c’est vrai pour toutes les espèces végétales en raison des séquences de catalase limitées pour d’autres espèces végétales dans GenBank. D’après les données de structure cristalline des catalases bactériennes et mammaliennes, les hélices α sont les structures typiques dans la partie C-terminale de ces catalases (29), mais aucune structure α-hélicoïdale amphiphile basique n’existe dans cette partie selon la projection de roue hélicoïdale.,

pour vérifier si la CaM se lie à la catalase purifiée de planta, la catalase du tabac a été purifiée à partir des feuilles sur la base de Durner et Klessig (10). Une colonne CaM-Sepharose a été utilisée comme dernière étape du processus de purification. Le résumé des étapes de purification de la catalase à l’aide de 1 000 g de feuilles de tabac est présenté dans le tableau 1. La catalase du tabac a été purifiée jusqu’à une homogénéité proche selon la coloration SDS / PAGE et argentée (fig. 3, voie 1). L’identité de la Catalase a été confirmée par Western bloting avec un mAb contre la catalase du tabac (Fig. 3, voie 3)., La liaison CaM à la catalase du tabac purifiée a été démontrée par les approches suivantes. (i) une colonne CaM-Sepharose a été utilisée pour la purification de la catalase du tabac. Le taux de récupération pour cette étape était de 81% (Tableau 1), ce qui suggère que la plus grande partie de la catalase des feuilles de tabac est une protéine liant la CaM. (ii) La CaM marquée au 35S a été utilisée pour tester la liaison à la catalase purifiée en présence de CaCl2 de 0,2 mM (fig. 3, voie 5). L’AtCat3 Recombinant a été utilisé comme témoin (fig. 3, voies 2, 4 et 6). Ajout de 0.,L’EGTA de 4 mM a aboli la liaison de la CaM, suggérant que la CaM se lie à la catalase végétale de manière dépendante du Ca2+. Des tests de liaison à la CaM ont également été effectués pour déterminer si elle se lie à la catalase fongique, bovine ou humaine. Les résultats ont révélé qu’aucune de ces catalases Non végétales ne présentait de liaison CaM (données non présentées), ce qui est en accord avec les comparaisons de séquences d’acides aminés (Fig. 2).,

le site de liaison CaM ou les régions étroitement juxtaposées dans d’autres protéines de liaison CaM caractérisées fonctionnent souvent comme des domaines autoinhibiteurs ou pseudosubstrates. Cette région maintient les protéines cibles dans un état inactif en l’absence de signal Ca2+, comme dans la protéine kinase (30) chimérique Ca2+/CaM dépendante de la plante et la glutamate décarboxylase (31). Pour étudier l’importance de la liaison de la CaM aux catalases végétales, les activités catalytiques de L’AtCat3 recombinante et de la catalase du tabac purifiée ont été mesurées en présence et en absence de CaCl2 et de CaM., Des expériences similaires ont également été réalisées en utilisant d’autres catalases Non végétales. L’AtCat3 recombinant exprimé par E. coli n’a montré aucune activité. Des résultats similaires ont été obtenus dans un autre laboratoire (Zhixiang Chen, communication personnelle). Cela peut être dû à l’incapacité de former la structure correcte de la catalase recombinante, car la catalase active est un tétramère composé de quatre sous-unités identiques ou similaires (6, 10, 26). En revanche, la catalase de tabac purifiée a montré un changement significatif D’activité dépendant du Ca2+/CaM pendant les étapes de purification (Tableau 1)., Les effets stimulateurs du Ca2 + / CaM sont d’environ 2,2 fois à chaque étape, à l’exception de l’échantillon obtenu après la chromatographie CaM-Sepharose. Il a montré une stimulation plus élevée de l’activité de la catalase (2,5 fois) peut-être en raison de l’élimination de la fraction de catalase non liée au Ca2+/CaM (Tableau 1). La fraction catalase non liée au Ca2+/CaM avait une activité spécifique de 59,6 unités (activité basale). Cependant, le Ca2 + / CaM n’a pas stimulé l’activité de cette fraction de catalase (données non présentées)., Ces résultats indiquent que le Ca2+ / CaM est capable d’activer la catalase du tabac dans la fraction obtenue après chromatographie CaM-Sepharose, ce qui correspond aux résultats de liaison CaM. Pour comparer les effets du Ca2+ / CaM sur l’activité des catalases de différentes sources, l’activité relative a été utilisée, car il existe une différence significative dans l’activité spécifique des catalases de différentes espèces. Par exemple, A. niger catalase a l’activité spécifique de 5,7 unités; catalase du foie bovin, 51,9 unités; érythrocytes humains, 39,5 unités; catalase du tabac, 63.,1 unités (en l’absence de Ca2 + / CaM). Figue. 4A montre que CaCl2 seul ou CaM seul n’a eu aucun effet stimulant sur l’activité catalase du tabac (environ 40% de l’activité maximale). Aucune différence d’activité catalytique n’a été observée chez les catalases fongiques, bovines ou humaines en présence ou en absence de Ca2+, CaM et Ca2+/CaM (Fig. 4A). En remplaçant CaCl2 par MgCl2, il n’y a pas eu de changement significatif dans l’activité de la catalase du tabac en présence ou en absence de CaM (données non présentées)., Pour mieux documenter l’effet du Ca2+/CaM sur l’activité de la catalase végétale, 10 µM du peptide correspondant à la région de liaison à la CaM AtCat3 (415-451) ont été ajoutés à chaque mélange réactionnel. Les catalases Non végétales n’ont pas été affectées par l’addition du peptide. Cependant, L’effet stimulant du Ca2+ / CaM sur l’activité catalase du tabac a été aboli par l’addition du peptide (Fig. 4A). De plus, l’effet inhibiteur du peptide sur l’activité de la catalase du tabac dépendait de la concentration du peptide (Fig. 4B)., L’activité de la catalase a été inhibée d’environ 58%, ce qui est proche de l’activité basale de la catalase. Cependant, le peptide n’a eu aucun effet sur l’activité de la catalase bovine à toutes les concentrations testées (Fig. 4A). Ces résultats suggèrent que le Ca2+ / CaM a un effet stimulant sur la catalase végétale purifiée, mais n’a aucun effet sur les catalases Non végétales.

on sait que la catalase est une enzyme peroxisomique prédominante, mais elle existe également dans les mitochondries et le cytoplasme (32). Par exemple, le maïs Cat3, qui pourrait être une catalase de liaison CaM basée sur la comparaison de séquences d’acides aminés, est une protéine mitochondriale (33). Nos résultats (fig. 1-4) démontrent que la CaM se lie à la catalase végétale et régule son activité. Pour démontrer la présence de cette activité régulatrice in vivo, nous avons étudié si la CaM coexiste avec la catalase dans les peroxysomes des plantes., Les organites des extraits de cotylédons de citrouille étiolés ont été séparés par centrifugation de densité de saccharose. Pour éliminer la contamination des protéines cytosoliques qui pourraient être présentes dans la solution ou simplement associées à la membrane peroxisomique, les peroxisomes isolés ont été traités avec la protéinase K. DE cette façon, les protéines peroxisomiques protégées de la protéase par la membrane peroxisomique n’ont pas été digérées (34, 35). L’identité des fractions peroxisomiques a été prouvée en mesurant l’activité de la catalase (35)., La CaM est très conservée à travers les royaumes (13-16), c’est pourquoi nous avons fait une analyse occidentale avec un anticorps anti-humain CaM. Comme témoin, la cam pcm6 recombinante de pomme de terre a été utilisée (fig. 5, voie 3). Fait intéressant, une bande de taille similaire à PCM6 était présente dans les fractions peroxisomiques, mais l’intensité était considérablement plus faible que celle de la CaM cytosolique (Fig. 5). Ces résultats indiquent que la CaM et la catalase sont colocalisées dans les peroxysomes. CaM est une petite protéine acide qui est principalement exprimée dans le cytoplasme., Cependant, chez les plantes, il a été démontré que la CaM est présente dans plusieurs organites tels que le noyau et les chloroplastes (36, 37) et la matrice extracellulaire (38). En outre, des protéines régulées par la CaM existent dans la matrice extracellulaire, le noyau et les chloroplastes (38-40). La façon dont la came traverse la membrane n’est pas claire. Des études récentes indiquent que les modifications post-traductionnelles jouent un rôle dans la translocation de certaines isoformes CaM. Par exemple, une protéine de type CaM de pétunia, CaM53, est associée à la membrane plasmique lorsque la protéine est prénylée. Si la prénylation est inhibée, la CaM53 se trouve principalement dans le noyau (41).,

À notre connaissance, il n’existe pas de rapport qui traite de la concentration de calcium dans les peroxysomes., Sur la base d’un modèle récent modifié de la biogenèse du peroxysome, le peroxysome provient du réticulum endoplasmique (ER) au moyen de vésicules préperoxisomales (42). On sait que L’ER est l’un des pools de calcium intracellulaire. Ainsi, la concentration de calcium dans les peroxysomes pourrait être aussi élevée que dans les urgences. Mesurer la concentration de calcium peroxisomique et surveiller tout lien entre le changement de la concentration de calcium dans le cytoplasme et le peroxysome devrait aider à comprendre comment la catalase peroxisomique est régulée par Ca2+/CaM., Par exemple, la concentration de calcium libre pourrait être mesurée chez les plantes transgéniques avec l’aequorine reconstituée avec un signal de ciblage du peroxysome. L’aequorine est une protéine luminescente sensible au calcium, dont la luminescence signale directement le changement de calcium (43). Étant donné que le peroxysome est un organite majeur qui élimine les ROS toxiques, principalement H2O2, il est raisonnable de supposer que l’activité de la catalase peroxisomale reste élevée tout le temps pour dégrader H2O2 in situ à un rythme rapide. Cependant, les fluctuations du calcium cytosolique pourraient avoir un effet majeur sur l’activité de la catalase cytosolique., Il est important de souligner que toutes les catalases ne sont pas des protéines de liaison à la CaM. Par conséquent, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour examiner l’importance du Ca2+/CaM dans le contrôle de l’activité de la catalase dans différents organites.

Les stress biotiques et abiotiques déclenchent un afflux de Ca2+, et l’augmentation du CA2+ cytosolique stimule la production de H2O2, qui se diffuse dans les cellules environnantes en tant que messager et induit la réponse physiologique (19, 20). Nos résultats suggèrent qu’une augmentation du Ca2 + cytosolique peut réduire les niveaux de H2O2 au moyen D’une stimulation de L’activité de la catalase médiée par le Ca2+/CaM (Fig. 4)., Nous proposons que l’augmentation du Ca2 + cytosolique a un double rôle dans la régulation de L’homéostasie H2O2 (Fig. 6): (i) la régulation positive génère du H2O2 en activant directement la NADPH oxydase, qui a une affinité pour le Ca2+ (22) et produit indirectement plus de NADPH au moyen de la NAD kinase régulée par le Ca2+/CaM (23); et (ii) la régulation négative réduit le H2O2 en stimulant l’activité de la catalase par 4)., Les changements induits par le Signal dans les transitoires de Ca2+ peuvent différer dans la fréquence, la durée, l’amplitude et la localisation spatiale des oscillations, et le mode de propagation spatiale, ce qui conduit à des effets différentiels sur les protéines cibles du calcium (12, 44).