DISCUSSION
La tache de Gram est la procédure de coloration la plus largement utilisée en bactériologie. On l’appelle une tache différentielle car elle différencie les bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Les bactéries qui colorent le violet avec la procédure de coloration de Gram sont appelées Gram positives; celles qui colorent le rose sont dites Gram négatives. Les Termes positif et négatif n’ont rien à voir avec la charge électrique, mais désignent simplement deux groupes morphologiques distincts de bactéries.,
Les bactéries Gram-positives et gram-négatives se colorent différemment en raison de différences fondamentales dans la structure de leurs parois cellulaires. La paroi cellulaire bactérienne sert à donner à l’organisme sa taille et sa forme ainsi qu’à prévenir la lyse osmotique. Le matériau dans la paroi cellulaire bactérienne qui confère une rigidité est le peptidoglycane.
dans les micrographies électroniques, la paroi cellulaire Gram-positive apparaît comme une paroi large et dense de 20 à 80 nm d’épaisseur et constituée de nombreuses couches interconnectées de peptidoglycane (Figures 1a et 1B). Chimiquement, 60 à 90% de la paroi cellulaire gram-positive est du peptidoglycane., Les acides teichoïques sont entrelacés dans la paroi cellulaire des gram-positifs. Les acides teichoïques, qui s’étendent à travers et au-delà du reste de la paroi cellulaire, sont composés de polymères de glycérol, de phosphates et du ribitol d’alcool de sucre. Certains ont un lipide attaché (acide lipotéichoïque). La surface externe du peptidoglycane est parsemée de protéines qui diffèrent selon la souche et l’espèce de la bactérie.,
la paroi cellulaire Gram-négative, quant à elle, ne contient que 2-3 couches de peptidoglycane et est entourée d’une membrane externe composée de phospholipides, de lipopolysaccharides, de lipoprotéines et de protéines (Figures 2a et 2b). Seulement 10% – 20% de la paroi cellulaire gram-négative est peptidoglycane. Les phospholipides sont situés principalement dans la couche interne de la membrane externe, tout comme les lipoprotéines qui relient la membrane externe au peptidoglycane., Les lipopolysaccharides, situés dans la couche externe de la membrane externe, sont constitués d’une partie lipidique appelée lipide A incorporée dans la membrane et d’une partie polysaccharidique s’étendant vers l’extérieur à partir de la surface bactérienne. La membrane externe contient également un certain nombre de protéines qui diffèrent selon la souche et l’espèce de la bactérie.,
pour plus d’informations sur la paroi cellulaire Gram-négative et gram-positive, consultez les objets D’apprentissage suivants dans votre guide de cours:
- La paroi cellulaire procaryotique; Unité 1, Section IIB2
- La paroi cellulaire Gram-Positive; Unité 1, Section IIB2a
- La paroi cellulaire Gram-négative; Unité 1, Section IIB2b
la
1. Les bactéries sont d’abord colorées avec le colorant de Base crystal violet. Les bactéries Gram-positives et Gram-négatives deviennent directement colorées et apparaissent violettes après cette étape.,
2. Les bactéries sont ensuite traitées avec la solution d’iode de Gram. Cela permet de mieux retenir la tache en formant un complexe cristallin insoluble violet-iode. Les bactéries Gram-positives et Gram-négatives restent violettes après cette étape.
3. Le décolorant de Gram, un mélange d’alcool éthylique et d’acétone, est ensuite ajouté. C’est la différentielle de l’étape. Les bactéries à Gram positif retiennent le complexe cristallin violet-iode tandis que les bactéries à Gram négatif sont décolorées.
4. Enfin, la contre-coloration safranine (également un colorant de base) est appliquée., Puisque les bactéries Gram-positives sont déjà colorées en violet, elles ne sont pas affectées par la contre-coloration. Les bactéries Gram-négatives, qui sont maintenant incolores, sont directement colorées par la safranine. Ainsi, les Gram-positifs apparaissent en violet et les gram-négatifs en rose.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, auteurs, Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.,
avec la théorie actuelle derrière la coloration Gram, on pense que chez les bactéries Gram-positives, le violet cristallin et l’iode se combinent pour former une molécule plus grande qui précipite à l’intérieur de la cellule. Le mélange alcool / acétone provoque alors une déshydratation du peptidoglycane multicouche, diminuant ainsi l’espace entre les molécules et amenant la paroi cellulaire à piéger le complexe cristallin violet-iode à l’intérieur de la cellule., Dans le cas de bactéries à Gram négatif, le mélange alcool/acétone, étant un solvant lipidique, dissout la membrane externe de la paroi cellulaire et peut également endommager la membrane cytoplasmique à laquelle le peptidoglycane est attaché. Les quelques couches de peptidoglycane sont incapables de retenir le complexe cristallin violet-iode et la cellule est décolorée.
Il est important de noter que la Gram-positivité (la capacité de retenir le complexe violet-iode du cristal violet) n’est pas un phénomène tout ou Rien mais une question de degré., Plusieurs facteurs peuvent entraîner une coloration Gram-positive de L’organisme:
1. La méthode et les techniques utilisées. Une surchauffe pendant la fixation de la chaleur, une décoloration excessive avec de l’alcool et même un lavage excessif avec de l’eau entre les étapes peuvent entraîner la perte du complexe cristallin violet-iode par les bactéries Gram-positives.
2. L’âge de la culture. Les Cultures de plus de 24 heures peuvent perdre leur capacité à retenir le complexe cristallin violet-iode.
3. L’organisme lui-même., Certaines bactéries à Gram positif sont plus capables de retenir le complexe cristallin violet-iode que d’autres.
Par conséquent, il faut utiliser des techniques très précises dans la coloration de Gram et interpréter les résultats avec discrétion.
cultures de plaques de gélose de soja Trypticase D’Escherichia coli (un petit bacille à Gram négatif) et de Staphylococcus epidermidis (un coccus à Gram positif avec un arrangement de staphylocoque).
PROCÉDURE (pour être fait individuellement)
1., Escherichia coli
un. Chaleur-correction d’un frottis d’Escherichia coli comme suit:
1. À l’aide du flacon compte-gouttes d’eau désionisée qui se trouve dans votre grille de coloration, placez 1/2 d’une goutte d’eau de taille normale sur une glissière propre en touchant le compte-gouttes à la glissière (Figure 1). Altenately, utilisez votre boucle d’inoculation stérilisée pour placer une goutte d’eau désionisée sur la glissière.
2., À l’aide de votre boucle d’inoculation stérile, retirez aseptiquement une petite quantité de culture de la surface de la gélose et touchez – la doucement 2 à 3 fois jusqu’à ce que l’eau devienne visiblement trouble (Figure 2). Un bon frottis avec la bonne quantité de bactéries est essentiel à la coloration Gram.
- Trop de bactéries sur la diapositive pourrait entraîner une sous-décoloration; trop peu pourrait conduire à la décoloration.
3. Incinérer les bactéries restantes sur la boucle d’inoculation., Si trop de culture est ajoutée à l’eau, vous ne verrez pas de bactéries individuelles tachées et vous n’aurez peut-être pas de tache de gramme fiable.
4. Une fois la boucle d’inoculation refroidie, étalez la suspension sur environ la moitié de la lame pour former un film mince. Un frottis correctement préparé avec la bonne quantité de bactéries devrait ressembler à la Fig. 3.
5. Laissez cette suspension mince sécher complètement à l’air (Figure 4). Le frottis doit être complètement sec avant que la lame ne soit fixée à la chaleur!
6., Pour fixer les bactéries à la chaleur sur la lame,ramassez la lame séchée à l’air avec une pince à lamelles et maintenez le fond de la lame en face du frottis près de l’ouverture du micro-incinérateur pendant 10 Secondes (Figure 5) comme l’a démontré votre instructeur. Si la lame n’est pas suffisamment chauffée, toutes les bactéries se laveront. Si elle est surchauffée, l’intégrité structurelle des bactéries peut être endommagée.
B. colorer avec du Violet Cristal de Hucker pendant une minute (Figure 6). Laver doucement avec de l’eau (Figure 7). Secouez l’excès d’eau mais ne séchez pas entre les étapes.
C., Tachez avec la solution d’iode de Gram pendant une minute (Figure 8) et lavez doucement avec de l’eau.
D. décolorer en ramassant la diapositive et en laissant le décolorant du Gram couler le long de la diapositive jusqu’à ce que le violet cesse de couler au bas de la diapositive (Figure 9).
- assurez-vous que tout le frottis est décoloré uniformément et que vous ne décolorez pas ou ne décolorez pas trop.
- laver immédiatement avec de l’eau.
e. colorer avec de la safranine pendant une minute (Figure 10)., Lorsque vous lavez l’excès de safranine, faites très attention à laver doucement et brièvement car il est possible de laver une partie de la sarfanine dans la bactérie.
F. éponger (Figure 11) et observer à l’aide de la microscopie à immersion dans l’huile.
2. Staphylococcus epidermidis
un. Chaleur-correction d’un frottis de Staphylococcus epidermidis comme suit:
1. À l’aide du flacon compte-gouttes d’eau désionisée qui se trouve dans votre grille de coloration, placez 1/2 d’une goutte d’eau de taille normale sur une glissière propre en touchant le compte-gouttes à la glissière (Figure 1)., Altenately, utilisez votre boucle d’inoculation stérilisée pour placer une goutte d’eau désionisée sur la glissière.
2. À l’aide de votre boucle d’inoculation stérile, retirez aseptiquement une petite quantité de culture de la surface de la gélose et touchez – la doucement 2 à 3 fois jusqu’à ce que l’eau devienne visiblement trouble (Figure 2).
- Trop de bactéries sur la diapositive pourrait entraîner une sous-décoloration; trop peu pourrait conduire à la décoloration.
3. Incinérer les bactéries restantes sur la boucle d’inoculation., Si trop de culture est ajoutée à l’eau, vous ne verrez pas de bactéries individuelles tachées et vous n’aurez peut-être pas de tache de gramme fiable.
4. Une fois la boucle d’inoculation refroidie, étaler la suspension sur environ la moitié de la lame pour former un film mince (Figure 3).
5. Laissez cette suspension mince sécher complètement à l’air (Figure 4). Le frottis doit être complètement sec avant que la lame ne soit fixée à la chaleur!
6., Pour fixer les bactéries à la chaleur sur la lame,ramassez la lame séchée à l’air avec une pince à lamelles et maintenez le fond de la lame en face du frottis près de l’ouverture du micro-incinérateur pendant 10 Secondes (Figure 5) comme l’a démontré votre instructeur. Si la lame n’est pas suffisamment chauffée, toutes les bactéries se laveront. Si elle est surchauffée, l’intégrité structurelle des bactéries peut être endommagée.
B. colorer avec du Violet Cristal de Hucker pendant une minute (Figure 6). Laver doucement avec de l’eau (Figure 7). Secouez l’excès d’eau mais ne séchez pas entre les étapes.
C., Tachez avec la solution d’iode de Gram pendant une minute (Figure 8) et lavez doucement avec de l’eau.
D. décolorer en ramassant la diapositive et en laissant le décolorant du Gram couler le long de la diapositive jusqu’à ce que le violet cesse de couler au bas de la diapositive (Figure 9).
- assurez-vous que tout le frottis est décoloré uniformément et que vous ne décolorez pas ou ne décolorez pas trop.
- laver immédiatement avec de l’eau.
e. colorer avec de la safranine pendant une minute (Figure 10)., Lorsque vous lavez l’excès de safranine, faites très attention à laver doucement et brièvement car il est possible de laver une partie de la sarfanine dans la bactérie.
F. éponger et observer à l’aide de la microscopie à immersion dans l’huile.
3. Assurez-vous de verser soigneusement le colorant utilisé dans votre bac de coloration dans le récipient de collecte des déchets de teinture, pas dans l’évier.
© Hussein Shoeb, auteur. Licence D’utilisation, ASM MicrobeLibrary.
B., La tache de la CAPSULE
DISCUSSION
de nombreuses bactéries sécrètent un revêtement visqueux et visqueux appelé capsule ou glycocalyx . Ceci est généralement composé de polysaccharide, de polypeptide ou des deux.
La capacité de produire une capsule est une propriété héritée de l’organisme, mais la capsule n’est pas absolument nécessaire d’composant cellulaire. Les Capsules ne sont souvent produites que dans des conditions de croissance spécifiques. Même si elles ne sont pas essentielles à la vie, les capsules P aident robablement les bactéries à survivre dans la nature., Les Capsules aident de nombreuses bactéries pathogènes et de la flore normale à résister initialement à la phagocytose par les cellules phagocytaires de l’hôte. Dans le sol et l’eau, les capsules aident à empêcher les bactéries d’être englouties par les protozoaires. Les Capsules aident également de nombreuses bactéries à adhérer aux surfaces et à résister ainsi au rinçage. Il permet également à de nombreuses bactéries de former des biofilms. Un biofilm est constitué de couches de populations bactériennes adhérant aux cellules hôtes et intégrées dans une masse capsulaire commune.,
pour plus d’informations sur les capsules bactériennes, consultez les objets D’apprentissage suivants dans votre guide de cours:
- Le Glycocalyx (Capsule) et la couche S; Unité 1, Section IIB4a
- La capacité de résister à L’engloutissement phagocytaire; Unité 3, Section B5b
organisme
culture de bouillon de lait écrémé D’Enterobacter aerogenes. Le lait écrémé fournit des nutriments essentiels pour la production de capsules et fournit également un fond légèrement tachable.
procédure (à effectuer individuellement)
1., Remuez la culture de bouillon de lait écrémé avec votre boucle et placez 2-3 boucles D’Enterobacter aerogenes sur une lame de microscope.
2. À l’aide de votre boucle d’inoculation, étalez l’échantillon pour couvrir environ un pouce de la lame.
3. Laissez complètement sécher à l’air. Ne chauffez pas fix. Les Capsules collent bien au verre et la chaleur peut détruire la capsule.
4. Tache avec du violet cristal pendant une minute.
5. Laver l’excès de colorant avec une solution de sulfate de cuivre à 20%.
6. Secouez l’excès de solution de sulfate de cuivre et épongez immédiatement.
7. Observer en utilisant la microscopie à immersion dans l’huile., L’organisme et le lait séché sur la lame vont ramasser le colorant violet tandis que la capsule restera incolore.
8. Assurez-vous de verser soigneusement le colorant utilisé dans votre bac de coloration dans le récipient de collecte des déchets de teinture, pas dans l’évier.
9. Observez la tache de capsule de démonstration de Streptococcus lactis, une bactérie encapsulée qui est la flore normale dans le lait.
A. La coloration de Gram
Faire des dessins de chaque bactérie sur votre coloration de Gram préparation.,
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| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., La tache de Capsule
faites un dessin de votre préparation de tache de capsule D’Enterobacter aerogenes et la tache de capsule de démonstration de Streptococcus pneumoniae.
Capsule tache
Streptococcus lactis
