Il faut un réel effort pour garder vos connaissances de base en biologie moléculaire et cellulaire fraîches, en plus de tout ce que vous avez à faire. Ne serait-il pas génial de s’il y avait un endroit où vous pourriez trouver des articles faciles à lire qui vous permettent de rafraîchir ces bases en seulement quelques minutes?
…j’espère que vous avez dit « oui”, car c’est le but de ma série D’articles « the Basics:”, que nous avons déjà et que nous continuerons à vous apporter périodiquement. Cet article explique les bases de la ligature de l’ADN.,
votre partenaire de ligature de l’ADN: ADN Ligase
L’ADN ligase (EC 6.5.1.1) est l’enzyme au cœur de la réaction de ligature de l’ADN. Il joint de manière covalente la colonne vertébrale phosphatée de L’ADN avec des extrémités cohésives émoussées ou compatibles (voir Figure 1) et son rôle naturel est de réparer les ruptures à double brin dans les molécules d’ADN. En biologie moléculaire, il est couramment utilisé pour l’insertion de fragments D’ADN générés par des enzymes de restriction dans les os dorsaux vectoriels. Les ligases commerciales sont fournies avec un tampon réactionnel contenant de L’ATP et du Mg2+, qui sont tous deux essentiels à l’activité de la ligase., Comme L’ATP peut être endommagé par des cycles de gel-dégel répétés, il est conseillé de faire des aliquotes du tampon (voir mon article « 5 conseils de ligature de L’ADN »).
la Figure 1. Extrémités cohésives et émoussées, prêtes pour la ligature de L’ADN!
Les deux étapes de l’ADN de réaction de ligature
L’ADN de réaction de ligature a deux étapes de base. Premièrement, les extrémités de L’ADN doivent entrer en collision par hasard et rester ensemble assez longtemps pour que la ligase les rejoigne. C’est la partie la plus inefficace de la réaction, mais elle est plus facile à basse température. Pourquoi?, Eh bien, comme vous le savez probablement, toutes les molécules se déplacent plus rapidement à des températures plus élevées, vous pouvez donc imaginer qu’il sera plus facile pour deux extrémités D’ADN de se heurter et de rester ensemble si elles flottent doucement à travers la solution à basse température, plutôt que de siffler comme elles le seraient à des températures plus élevées. Pour les extrémités cohésives, il y a une raison supplémentaire; des températures plus basses stabilisent la liaison hydrogène entre les nucléotides complémentaires, ce qui aide vraiment à maintenir les choses en place.
la Figure 2., Réaction enzymatique de la ligature de L’ADN
la deuxième étape est la réaction enzymatique, qui est représentée schématiquement sur la Figure 2.. L’ADN ligase catalyse la jonction du 3′-OH au 5′-phosphate via un mécanisme en deux étapes. Tout d’abord, le nucléotide AMP, qui est attaché à un résidu de lysine dans le site actif de l’enzyme, est transféré au 5′-phosphate. Ensuite, la liaison AMP-phosphate est attaquée par le 3 ‘ – OH, formant la liaison covalente et libérant AMP. Pour permettre à l’enzyme d’effectuer d’autres réactions, L’AMP dans le site actif de l’enzyme doit être reconstitué par L’ATP.,
Voici pourquoi la ligature de L’ADN à basse température peut aider
L’enzyme ADN ligase a une activité optimale à 25°C donc la réaction de ligature est effectuée à une température qui est un compromis entre les températures optimales pour rapprocher les extrémités de l’ADN (1°C) et la réaction enzymatique (25°C). Normalement 1h à 16°c est bien mais puisque rapprocher les extrémités de l’ADN est la partie la moins efficace de la réaction favoriser cela en abaissant la température à 4°C peut donner encore plus d’efficacité. Cependant, l’enzyme fonctionnera très lentement à cette température, donc longtemps (par exemple, nuit) le temps d’incubation est nécessaire.
initialement publié le 31 octobre 2007; mis à jour et republié le 5 décembre 2014.
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