Good Mood

résultats

échantillons non traités. Notamment, nous observons que, même dans les échantillons non colorés, les différences entre les gouttelettes d’eau et d’huile (Fig. 1 B et C) ou entre différents constituants de la cellule (fig. 1D) générer suffisamment de contraste pour les distinguer. Dans les cellules, les matériaux à Z supérieur tels que les sels, le phosphore et le fer, qui peuvent être concentrés dans différentes régions, ont tendance à améliorer le contraste. Figue., 1D montre une cellule non traitée d’ovaire de hamster chinois (CHO) dans un milieu de culture normal à température ambiante. Le contour de la cellule et le noyau avec sa structure interne sont clairement visibles, tout comme une série de particules sphériques sombres dans le cytoplasme. L’identification de ces particules en tant que gouttelettes lipidiques est discutée ci-dessous.

Heavy-Metal Coloration. Les limites de résolution et de contraste lors de l’observation de matériaux à faible Z suggèrent que des avantages substantiels peuvent être obtenus en colorant les cellules avec des marqueurs à haut Z tels que des taches denses aux électrons ou des étiquettes en or à nanoparticules., En effet, nous sommes capables de détecter des billes d’or dans l’eau jusqu’à un diamètre de 10 nm en utilisant des membranes ultra-fines (données non représentées).

la coloration différentielle des organites à l’intérieur des cellules à l’aide de matériaux electrondense est une norme dans la technique EM, bien qu’elle ne soit généralement pas appliquée pour les MEB. Figue. La figure 2 montre une riche variété de structures à l’intérieur de cellules cultivées qui ont été cultivées directement sur la membrane de séparation, puis fixées et colorées avec de l’acétate d’uranyle (8). Les organites intracellulaires sont clairement visibles, y compris les détails internes des mitochondries (Fig. 2C), fibres de contrainte d’actine (Fig., 2D), et des structures tubulaires et cytosquelettiques complexes (Fig. 2 A et B). L’énergie du faisceau plus élevée dans la Fig. 2C sonde la structure interne, alors qu’à plus faible énergie (Fig. 2D), la surface proche de la membrane est visualisée. Ainsi, différentes énergies peuvent être utilisées pour obtenir des informations tridimensionnelles.

marqueurs D’or nanoparticules. La haute résolution et la spécificité de la détection peuvent être obtenues par la liaison d’anticorps ou d’autres ligands., Comme avec d’autres méthodes EM, l’étiquetage est fait le plus commodément en utilisant des nanoparticules d’or. Contrairement à transmission EM (TEM), qui n’échantillonne que des sections très minces et souvent arbitraires, wet SEM permet une commutation rapide entre la vue locale et globale de l’étiquetage sur toute la cellule. Figue. 3 A et B montrent comment des anticorps monoclonaux antiépidermiques marqués à l’or de nanoparticules de 40 nm ont été utilisés pour marquer les récepteurs du facteur de croissance épidermique sur des cellules cancéreuses A431 intactes., La Fixation est souvent utile et pratique même en SEM humide et peut faciliter l’étiquetage ainsi que le transfert au microscope. Les cellules présentées ici sont également colorées avec de l’acétate d’uranyle, ce qui permet l’alignement des récepteurs marqués avec la structure générale des cellules. Le contraste élevé et la taille uniforme des nanoparticules permettent une identification et une localisation sans ambiguïté. La connaissance de la localisation précise des molécules à récepteur unique ouvre la possibilité de mesurer des événements tels que la dimérisation des récepteurs induite par le facteur de croissance épidermique., La coloration des cellules n’est pas nécessaire pour l’étiquetage, et nous avons inclus une image de cellules non colorées et marquées (Fig. 7, qui est publié comme information complémentaire sur le site Web des PNAS). Une image montre également que le marquage des parties internes de la cellule est possible (Fig. 8, qui est publié comme information à l’appui sur le site web PNAS), dans ce cas, le marquage des mitochondries avec des perles d’or. Le marquage des filaments d’actine à l’intérieur des cellules a également été réalisé en utilisant des particules d’or subnanométriques, suivies d’une amélioration de l’argent (données non représentées).

Un exemple de l’or, de l’étiquetage sur les bactéries est donné dans la Fig. 3C . Ici, le récepteur putatif de la gastrine de Helicobacter pylori (9) est détecté par incubation avec des complexes de gastrine bioinylée et de nanoparticules d’or 20 nm enrobées de streptavidine. L’administration de la gastrine bioinylée avant celle de l’or revêtu de streptavidine n’a donné presque aucune fixation de nanoparticules à la bactérie. Ce résultat a été obtenu indépendamment du temps entre les deux étapes, ce qui suggère que L’absorption de gastrine dans H. pylori est presque immédiate., Le fait que la gastrine complexée ne soit pas entrée dans les cellules indique la possibilité de définir les limites de la taille des particules pouvant être internalisées par les bactéries.

comparaison des Techniques D’imagerie (Trypanosoma brucei). Il est utile de comparer cette technologie avec les techniques d’imagerie existantes utilisant un système à modèle unique. Une telle étude est détaillée dans la Fig. 4, en utilisant la forme procyclique parasite T. brucei qui se propage dans l’intestin moyen de la mouche tsé-tsé. Les trois premières images présentent les modes d’imagerie existants: microscopie optique à fluorescence (fig., 4A), microscopie de contraste d’interférence différentielle (fig. 4B), et TEM (fig. 4C ). La force des techniques existantes est apparente: marquage localisé en fluorescence et sections détaillées en TEM. L’optique non traitée (Fig. 4B) et humide-SEM (fig. 4D) les images délimitent les bordures de la cellule mais sont peu contrastées et manquent de détails. Les deux mettent l’accent sur le noyau, mais les autres organites qui apparaissent dans l’image de contraste d’interférence différentielle ne sont pas clairement identifiés, tandis que l’image humide-SEM fait ressortir les gouttelettes lipidiques à un avantage. Coloration au tétroxyde d’Osmium (fig., 4E) n’est pas aussi utile dans ce système, soulignant principalement les gouttelettes lipidiques et certains organites internes non identifiés. L’imagerie la plus forte est vue sur la Fig. 4F, pour lequel une coloration à l’acétate d’uranyle a été utilisée. L’avantage de l’imagerie intacte avec laquelle la cellule complète peut être vue (ainsi que ses structures internes fines qui peuvent être observées en détail) est apparent, en particulier par rapport à l’imagerie TEM (Fig. 4C ). Enfin, l’imagerie par voie humide du marquage spécifique des cellules entières avec des anticorps dirigés contre la principale protéine de revêtement de surface ancrée au glycosylphosphatidylinositol, la procycline EP (10), est illustrée à la Fig., 4 G et H. Fait intéressant, la procycline EP est connue pour couvrir uniformément toute la cellule, mais le signal observé est groupé. Nous attribuons cela à la tendance des radeaux lipidiques sous-jacents à se regrouper sous l’influence d’anticorps, un processus que la fixation dans le formaldéhyde est incapable de prévenir. Les marqueurs d’or permettent également d’élucider la conformation tridimensionnelle de la cellule d’une manière qui rappelle ce que la SEM standard peut représenter (une excellente image SEM représentative de T. brucei peut être trouvée à http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

Évidemment, TEM aura une meilleure résolution, en général, que humide SEM, mais les images présentées dans l’exemple de T. brucei pour la comparaison sont « typiques” images obtenues dans le même laboratoire., Étant donné que la SEM humide est différente dans son utilité de la TEM et de la microscopie optique, chez T. brucei, elle peut être considérée comme une capacité complémentaire importante, et on peut s’attendre à ce que l’image complète soit donnée par une combinaison de techniques optiques, TEM et SEM humide.

les coupes de Tissus. Le SEM humide peut être utilisé pour des échantillons épais tels que des fragments de tissu en montant simplement le spécimen contre la membrane. La profondeur d’échantillonnage limitée des BSE permet l’imagerie d’une” section virtuelle », s’étendant de la surface à une profondeur définie allant jusqu’à quelques micromètres sans nécessiter de coupe mince.,

Fig. 5 A et B montre la visualisation directe de tissus non traités de souris. Figue. 5A est une image à petit grossissement du tissu cardiaque. L’organisation des cellules musculaires est évident. Zoom sur une cellule (fig. 5B) donne une vue vivante du noyau et des organites intracellulaires, éventuellement des mitochondries, et de leur dispersion dans la cellule. Comme indiqué ci-dessus pour les cellules en culture, la coloration des tissus est avantageuse mais pas impérative et peut améliorer la visualisation de nombreuses caractéristiques. Figue. 5 C et D montre une région du cortex rénal d’un rat., La coloration (ferricyanure de potassium) accentue l’organisation globale et les contacts cellulaires au sein de l’épithélium des tubules rénaux. Un ajustement minutieux des conditions de coloration et d’imagerie peut révéler des informations différentes et complémentaires telles que l’architecture tissulaire; par exemple, les tissus colorés avec de l’acétate d’uranyle donnent une image claire de la matrice extracellulaire (données non représentées).

Simultanée de Photons Collection (CL). La détection de l’ESB en SEM humide peut être complétée par la collecte simultanée de photons., Le faisceau d’électrons à balayage excite les molécules de l’échantillon, qui peuvent alors émettre de la lumière à des longueurs d’onde caractéristiques (CL). L’intensité lumineuse est ensuite utilisée pour obtenir une image de la distribution des molécules scintillantes, soit endogènes à la cellule, soit des étiquettes qui peuvent être introduites extraneously. Cette image est obtenue simultanément avec l’imagerie par ESB à une résolution limitée par les interactions électron-matière et non par la diffraction de la lumière (6). Nous avons inséré un guide de lumière dans le fluide sous l’échantillon, qui guide la lumière émise vers un photomultiplicateur., Cette configuration permet un bon couplage et une collecte efficace des photons excités par le faisceau d’électrons sans compromettre l’efficacité de la détection simultanée de l’ESB.

Fig. La figure 6 montre des cellules CHO non traitées, visualisées simultanément par L’ESB et des photons. Dans La Fig. 6A, les bordures cellulaires sont clairement délimitées dans le mode d’imagerie électronique, et le noyau (ainsi que ses nucléoles) sont proéminents, tout comme les taches sombres ≈1 µm autour du noyau. Ceux-ci apparaissent dans le cytoplasme de toutes les cellules eucaryotes que nous avons étudiées, et bien que leur nombre varie, ils sont généralement dispersés autour du noyau., Dans L’image CL montrée à la Fig. 6B, le contour et le noyau de la cellule sont clairement définis, indiquant une distribution de molécules scintillantes (similaire à l’autofluorescence) dans la cellule. Dans ce mode, les mêmes taches sont caractérisées par une émission élevée de photons. La combinaison d’un signal cathodoluminescent élevé et d’une teneur élevée en carbone est typique des gouttelettes lipidiques (11), qui participent au stockage d’énergie de la cellule (12)., Un test indépendant d’ajout d’acide oléique de 200 µM a provoqué une forte prolifération de ces gouttelettes dans la cellule (données non présentées), ce qui correspond à l’idée que les taches observées sont des gouttelettes lipidiques.

La SEM humide présente un avantage par rapport aux techniques de SEM standard dans la conservation des lipides, en particulier dans les grands agrégats tels que les gouttelettes lipidiques. L’élimination du besoin de séchage sauve les lipides des solvants organiques qui peuvent les dissoudre. Bien que le traitement à l’osmium préserve certaines bicouches lipidiques, dans les agrégats plus gros, l’osmium réagit rapidement pour créer une croûte externe qui ne laisse pas entrer l’osmium, laissant les agrégats vulnérables au traitement ultérieur par solvant organique., Dans les préparations cryogéniques, la tendance du processus de clivage à se fissurer le long des limites lipidiques–eau est également un danger pour les grandes structures lipidiques.

l’imagerie à haute résolution des marqueurs est une capacité hautement souhaitable du mode de détection CL, nécessitant le développement d’étiquettes pour des molécules spécifiques dans les cellules. Dans La Fig. 9, qui est publié comme information à l’appui sur le site Web de PNAS, nous démontrons que des billes fluorescentes standard de 0,2 µm de diamètre émettent des photons intensément sous le faisceau d’électrons et peuvent être imagées avec une résolution de ≈100 nm (7)., L’imagerie des perles plus petites est limitée par une faible luminosité, entraînant le développement de perles de scintillation spécialisées à petit diamètre . Étant donné que le mécanisme d’excitation de la scintillation est le plus fort lorsque le faisceau frappe directement le cordon, nous nous attendons à ce que cela puisse étendre la résolution de l’imagerie fluorescente d’un ordre de grandeur au-delà de celui disponible avec la microscopie optique.