Good Mood

Einführung

die Next-generation-sequencing (NGS) hat sich schnell erweitert in der klinischen Einstellung in haemato-Onkologie und Onkologie, wie es kann bringen große nutzen für die Diagnose, die Auswahl der Behandlung, und/oder die Prognose für viele Patienten (1)., Kürzlich wurden mehrere Artikel über die Validierung von Deep Targeted NGS in der klinischen Onkologie veröffentlicht (2, 3), darunter eine umfassende Empfehlung der Association for Molecular Pathology und des College of American Pathologen (1). Die mangelnde Standardisierung gezielter NGS-Methoden schränkt ihre Umsetzung in der klinischen Praxis jedoch immer noch ein (4).

Eine Herausforderung ist insbesondere der korrekte Nachweis von Mutationen bei niedrigen Variantenallelfrequenzen (VAF) und die Standardisierung der Sequenzierungsdeckungstiefe (1, 5, 6)., Dies ist besonders wichtig für Mutationen, die klinische Auswirkungen bei subklonalen Frequenzen haben (1), wie im Fall von TP53-Genmutationen (TP53mut) bei chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) (7, 8). TP53-Aberrationen (TP53mut und / oder Chromosom-17p-Deletion) gehören zu den stärksten prognostischen und prädiktiven Markern, die Behandlungsentscheidungen bei CLL leiten (9)., Heutzutage empfiehlt die Europäische Forschungsinitiative für chronische lymphozytäre Leukämie (ERIC) den Nachweis von TP53mut mit einer Nachweisgrenze (LOD) von mindestens 10% VAF (10), und es gibt eine wachsende Anzahl von Beweisen, die sich mit den klinischen Auswirkungen von kleinen TP53-mutierten Unterklassen befassen CLL (7, 8).

Sanger-Sequenzierung und Deep Targeted NGS sind derzeit die am häufigsten verwendeten Techniken für die TP53mut-Analyse (10) sowie für die Analyse anderer Gene mit klinischen Auswirkungen bei niedrigen Allelfrequenzen., Obwohl die Sanger-Sequenzierung einen relativ zugänglichen Sequenzierungsansatz bietet, fehlt ihr aufgrund ihrer Nachweisgrenze von 10-20% mutierter Allele die Empfindlichkeit, die zum Nachweis von Unterklassen erforderlich ist (10). Die NGS-basierte Analyse hat somit in Diagnoselabors zur Erkennung somatischer Varianten an Bedeutung gewonnen, und verschiedene technische Entwicklungen von Fehlerkorrekturstrategien, sowohl rechnerisch als auch experimentell, werden zur genauen Identifizierung genetischer Variationen auf niedriger Ebene entwickelt (11)., Wir gehen daher auf die Bedeutung der korrekten Bestimmung der Sequenziertiefe in diagnostischen NGS ein, um eine sichere und reproduzierbare Detektion nicht nur bei niedrigen VAF-Varianten zu erhalten. Schließlich führten wir ein Verdünnungsexperiment durch, um unsere theoretischen Berechnungen zu bestätigen, und wir schließen mit der Diskussion unserer Erfahrungen mit dem diagnostischen Nachweis von TP53mut bei CLL-Patienten und weiteren Perspektiven zur NGS-Standardisierung in der Krebsdiagnostik.,

NGS-Sequenzierungstiefe und Fehlerrate

Die NGS-Sequenzierungstiefe wirkt sich direkt auf die Reproduzierbarkeit der Variantenerkennung aus: Je höher die Anzahl der ausgerichteten Sequenzlesungen ist, desto höher ist das Vertrauen in den Basisaufruf an einer bestimmten Position, unabhängig davon, ob der Basisaufruf der Referenzbasis entspricht oder mutiert ist (1). Mit anderen Worten, einzelne Sequenzierungsfehlerlesevorgänge sind statistisch irrelevant, wenn sie durch korrekte Lesevorgänge in die Unterzahl geraten., Somit sollte die gewünschte Abdeckungstiefe auf der Grundlage der beabsichtigten LOD, der Toleranz für falsch positive oder falsch negative Ergebnisse und der Fehlerrate der Sequenzierung (1, 11) bestimmt werden.

Unter Verwendung einer Binomialverteilung kann die Wahrscheinlichkeit falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse für eine gegebene Fehlerrate sowie die beabsichtigte LOD berechnet und der Schwellenwert für eine Variante, die eine gegebene Tiefe aufruft, geschätzt werden (1)., Beispielsweise beträgt die Wahrscheinlichkeit, 9 oder weniger mutierte Lesevorgänge zu erkennen, bei einer Sequenzierungsfehlerrate von 1%, einer mutierten Allelbelastung von 10% und einer Deckungstiefe von 250 Lesevorgängen gemäß der Binomialverteilung 0,01%. Daher beträgt die Wahrscheinlichkeit, 10 oder mehr mutierte Lesevorgänge zu erkennen, 99,99% (100-0, 01%), und der Schwellenwert für einen Variantenaufruf kann definiert werden. Mit anderen Worten, eine Abdeckungstiefe von 250 mit einem Schwellenwert von mindestens 10 mutierten Lesevorgängen hat eine 99.,99% Wahrscheinlichkeit, dass 10% der mutierten Allellastung durch den Variantenaufruf nicht übersehen werden (obwohl sie in einem anderen Verhältnis erkannt werden kann). Auf diese Weise wird das Risiko eines falsch negativen Ergebnisses stark minimiert. Andererseits hängt die Wahrscheinlichkeit von Fehlalarmen stark von der Sequenzierungsfehlerrate ab (da die Genauigkeit aller analytischen Messungen vom Signal-Rausch-Verhältnis abhängt) (1, 11). In unserem Beispiel beträgt die Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven Ergebnisses 0,025%; Die Rate der falsch positiven Ergebnisse ist jedoch nicht vernachlässigbar, wenn der LOD auf den Wert nahe der Fehlerrate verringert wird., Herkömmliche intrinsische NGS-Fehlerraten liegen zwischen 0,1 und 1% (Phred Quality Score von 20-30) (1, 11), abhängig von der Sequenzierungsplattform, dem GC-Gehalt der Zielregionen (12) und der Fragmentlänge, wie in Illumina High-End-Sequenzierung (13) gezeigt. Daher ist die Erkennung von Varianten bei VAFs <2% unabhängig von der Deckungstiefe von einem hohen Risiko eines falsch positiven Ergebnisses betroffen., Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass die Sequenzierungsfehlerrate nur für Fehler gilt, die durch die Sequenzierung selbst erzeugt werden, und keine anderen Fehler enthält, die während der DNA-Verarbeitung und Bibliotheksvorbereitung, insbesondere während Amplifikationsschritten, eingeführt werden, was die Fehlerraten weiter erhöht (1, 11).

Minimale Sequenzierungsabdeckung im klinischen Umfeld

Derzeit besteht kein Konsens über die minimal erforderliche Abdeckung in einem klinischen Umfeld unter Verwendung einer tiefen gezielten Resequenzierung durch NGS, und daher muss jedes Labor seine eigenen Parameter festlegen, um eine ausreichende Qualität zu erreichen (1, 5)., Bisher haben nur wenige Studien die Mindestdeckungskriterien für tiefe zielgerichtete NGS in der klinischen Onkologie empfohlen: 500 Deckungstiefe und ein LOD von 5% (2), 300-500 Deckungstiefe, ohne dem LOD zu trotzen (3), 250 Tiefe und ein LOD von 5% mit Schwellenwertanpassung an 1.000 Deckungstiefe ist bei heterogenen Varianten in Proben mit niedriger Tumorzellularität erforderlich (1) und 100 Tiefe mit mindestens 10 Variantenlesungen und einem LOD von 10% (10)., Entsprechend der binominalen Datenverteilung sollte in der Tat eine Abdeckungstiefe von 250 ausreichen, um 5% VAF mit einem Schwellenwert von variantenstützenden Lesevorgängen ≥5 zu erkennen (Abbildung 1). Andererseits würde eine NGS-Analyse mit einer Deckungstiefe von 100 zusammen mit einer Anforderung von mindestens 10% unterstützenden Lesewerten, wie vom ERIC-Konsortium empfohlen (10), zu einem Falsch-Negativ von 45% für Proben mit einem LOD von 10% führen., Um diese theoretischen Berechnungen zu bestätigen, führten wir zwei unabhängige Verdünnungsexperimente durch, um die Leistung der TP53 NGS-Analyse zum Nachweis von 10% VAF in einer Deckungstiefe von 100 Lesevorgängen zu schätzen. In der Tat haben wir 30% der falsch negativen Proben (5 positive Proben von 7 true-positiven Proben und 9 positive Proben von 13 true-positiven Proben) in zwei unabhängigen Sequenzierungsläufen nachgewiesen. Leider wird die falsch negative Rate bei gezielter Resequenzierung oft unterschätzt., Eine kürzlich durchgeführte Studie zur Untersuchung der laborinternen Ergebnisse der somatischen Variantendetektion mit VAFs zwischen 15 und 50% in 111 Labors mit gemeldeten LODs von 5-15% (6) zeigt, dass schwerwiegende Fehler in diagnostischen NGS auch bei Proben mit hohen Mutationslasten auf falsch negative Ergebnisse zurückzuführen sein können (6). Von drei gleichzeitigen falsch positiven Ergebnissen wurden alle Varianten korrekt erkannt, aber falsch charakterisiert (6)., Da Laboratorien nicht aufgefordert wurden, die Abdeckungstiefe für andere Regionen als die identifizierten Varianten zu melden (6), können wir nur davon ausgehen, dass eine geringe Abdeckung oder hohe Variantenaufrufschwellen zu den falsch negativen Ergebnissen beigetragen haben. Diese Ergebnisse unterstreichen ferner die Notwendigkeit standardisierter Deckungstiefenparameter in diagnostischen NGS unter Berücksichtigung von Sequenzierungsfehlern sowie assayspezifischen Fehlern.

Häufigkeit von TP53 – subklonalen Mutationen in CLL, die durch diagnostische NGS erkannt wurden

Um das Auftreten von niedrigem VAF in realen Umgebungen zu bewerten, haben wir unsere Kohorte von CLL-Patienten überprüft, die in unserem Diagnoselabor auf TP53mut untersucht wurden. Die TP53mut bewertet wurden wie bereits berichtet (14, 15). Kurz gesagt wurde TP53 (Exons 2-10 einschließlich 2 bp intronischer Überlappung, 5′ und 3 ‚ UTR) unter Verwendung von 100 ng gDNA pro Reaktion analysiert., Amplicon – basierte Bibliotheken wurden als Paarend auf MiSeq sequenziert (2×151, Illumina) mit minimalen Ziellesetiefen von 5,000 x. Der LOD von TP53mut wurde auf 1% festgelegt, und die Varianten im Bereich 1-3% wurden durch Replikation bestätigt. Die schriftliche Einwilligung wurde von allen Patienten eingeholt, die gemäß der Helsinki-Erklärung eingeschrieben waren, und die Studie wurde vom örtlichen Ethikkomitee genehmigt.

Von der diagnostischen Kohorte von 859 CLL-Patienten (April 2016–April 2019) waren 25% (215/859) positiv für TP53mut und von diesen 52,6% (113/215) durchgeführt Varianten mit VAF bei 10% oder niedriger., In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie (8) über das Vorhandensein von 63 und 84% TP53muts mit geringer Belastung (Sanger negativ) bei CLL-Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose bzw. zum Zeitpunkt der Behandlung und bestätigte die negativen Auswirkungen auf das Gesamtüberleben von TP53muts über 1% VAF zum Zeitpunkt der Behandlung (8).,

Calculator for Diagnostic NGS Settings for Detection of Subclonal Mutations

Um Labors bei der Bestimmung der minimalen korrekten Abdeckungsparameter zu unterstützen, bieten wir einen einfachen, benutzerfreundlichen theoretischen Rechner (Software) basierend auf der Binomialverteilung (Abbildung 2), der in der ergänzenden Datei beschrieben ist. Auf eine Web-(oder Desktop -) Anwendung und eigenständige Quellcodes in R kann auf Github zugegriffen werden: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Mit diesem Rechner können die korrekten Parameter der Sequenzierungstiefe und die entsprechende Mindestanzahl von Variantenlesungen für eine gegebene Sequenzierungsfehlerrate und beabsichtigte LOD leicht bestimmt werden. Darüber hinaus können Benutzer auch andere Fehler berücksichtigen, indem sie einfach Assay-spezifische Fehler zur Sequenzierungsfehlerrate hinzufügen und diesen Gesamtfehler als Eingabe in den Rechner verwenden. Zum Beispiel haben wir in unserem Fall der TP53-Mutationsanalyse mit dem Gesamtfehler von ~1.16% berechnet und somit unsere Mindestanforderungen an die Abdeckungstiefe auf 2,000 mit einem Schwellenwert von mindestens 40 Lesevorgängen für 3% VAF festgelegt.,

Obwohl diagnostische NGS im klinischen Umfeld für die Beurteilung somatischer Mutationen bei Krebs an Bedeutung gewonnen haben, schränkt eine unzureichende Standardisierung der Sequenzierungsparameter die Implementierung in der klinischen Praxis immer noch ein (1), hauptsächlich für Varianten, die bei niedrigen Allelfrequenzen vorhanden sind (4). Wir haben uns daher mit der technischen Frage der korrekten Bestimmung der Sequenziertiefe in diagnostischen NGS befasst, um sichere und reproduzierbare Erkennungen niedriger VAF-Varianten zu erhalten., Insbesondere führten wir theoretische Berechnungen durch, um die optimale Deckungstiefe für die gewünschte Wahrscheinlichkeit der Erkennung von Varianten bei niedrigen Allelfrequenzen unter Berücksichtigung der Sequenzierungsfehlerrate zu bestimmen. Darüber hinaus haben wir diese theoretischen Berechnungen durch Verdünnungsexperimente bestätigt. Basierend auf diesen Beobachtungen empfehlen wir eine Deckungstiefe von 1.650 oder höher (zusammen mit dem jeweiligen Schwellenwert von mindestens 30 mutierten Lesevorgängen), um ≥3% Varianten aufzurufen, um eine 99,9% ige Wahrscheinlichkeit der Variantenerkennung zu erreichen, wobei nur der herkömmliche NGS-Sequenzierungsfehler verwendet wird., Varianten im 1-3% VAF-Bereich können nur aufgerufen werden, wenn die erhaltenen Sequenzdaten von hoher Qualität sind (Durchschnitt Q30 > 90%) und/oder wenn die Varianten durch Replikation oder orthogonale Methode bestätigt werden (1, 11, 16). Wir bieten auch einen einfachen, benutzerfreundlichen theoretischen Taschenrechner (Software) an, der Labors bei der Lösung der richtigen Sequenziertiefe und der entsprechenden Mindestanzahl von Variantenlesungen unter Berücksichtigung der Sequenzierungsfehlerrate hilft. Unser einfacher Rechner kann helfen, die falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse in diagnostischen NGS zu minimieren.,

Dennoch wird die korrekte Sequenzierungstiefe auch durch assayspezifische Faktoren beeinflusst (1). Fehler können in vielen Phasen während der DNA-Verarbeitung und Bibliotheksvorbereitung auftreten. Die häufigsten sind Amplifikationsfehler, die während der Vorbereitung der NGS-Bibliothek auftreten (1, 12, 17). Andere häufige Fehlerquellen haben mit Bibliothekskomplexität (Anzahl der analysierten unabhängigen DNA-Moleküle), DNA-Qualität und Komplexität der Zielregion usw. zu tun. Alle möglichen assayspezifischen Fehler sollten durch Testdesign, Methodenvalidierung und Qualitätskontrolle behoben werden.,

Derzeit werden neue, sowohl rechnerische als auch experimentelle Fehlerkorrekturstrategien entwickelt, um die hohen Fehlerraten in diagnostischen NGS zu mildern (11). Zu den vielversprechendsten Fehlerkorrekturverfahren zählen bisher UMI (Unique Molecular Identifiers), die PCR-Fehler korrigieren (18), und Signal-Rausch-Korrekturansätze (11). Diese Fortschritte versuchen, die LOD zu reduzieren, wodurch die Sequenzierungsgenauigkeit erhöht wird, die für zukünftige Möglichkeiten in der NGS-Diagnose erforderlich ist.,

Um die Standardisierung in diagnostischen NGS zu verbessern, ist die Abschätzung der korrekten Abdeckungstiefe ein empfohlener Ausgangspunkt bei der Beurteilung von Schwellenwerten, die einen bestimmten NGS-Assay umgeben. Dennoch fehlt es nach wie vor an veröffentlichten Leitlinien zu den technischen Mindestanforderungen und deren Berichterstattung in NGS, die insbesondere für den Nachweis klonaler und subklonaler Mutationen in der Krebsdiagnostik von Bedeutung sind., Dies ist hauptsächlich auf die breite Palette von Bibliotheksvorbereitungsansätzen und zahlreiche Variablen zurückzuführen, die bei jedem spezifischen NGS-Assay eine Rolle spielen und schwer zu standardisieren sind, zusammen mit der Variabilität zwischen den Laboratorien. Daher ist die Definition von technischen Mindestanforderungen und deren Berichterstattung in NGS sehr wünschenswert., Basierend auf unserer Erfahrung mit diagnostischen NGS in der Hämatoonkologie empfehlen wir, mindestens folgende technische Parameter zu melden: LOD, Gesamtfehler des NGS-Assays (oder zumindest Sequenzierungsfehlerrate), Menge des DNA-Eingangs, Quelle und Qualität der DNA, minimale Abdeckungstiefe und der Prozentsatz der Zielbasen, die in dieser minimalen Tiefe sequenziert wurden, Gesamtzahl der Ziellesevorgänge, die die Variantenregion abdecken, und Anzahl der Lesevorgänge, die die Variante unterstützen. Besonderes Augenmerk sollte auf die NGS-Standardisierung der Formalin-Fixed Paraffin-embedded (FFPE) Proben (19, 20) gelegt werden.,

Zusammengenommen unterstreicht unsere Studie die Bedeutung der korrekten Sequenzierungstiefe und der minimalen Anzahl von Lesevorgängen, die für eine zuverlässige und reproduzierbare Erkennung von Varianten mit niedrigem VAF in diagnostischen NGS erforderlich sind. Die Berechnung der korrekten Sequenziertiefe für eine gegebene Fehlerrate mit unserem benutzerfreundlichen theoretischen Rechner (Software) kann dazu beitragen, die falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse in diagnostischen NGS in Situationen zu minimieren, die unter anderem mit subklonalen Mutationen zusammenhängen., Die strengen Tests und standardisierten Mindestanforderungen für diagnostische NGS sind besonders wünschenswert, um korrekte Ergebnisse im klinischen Umfeld zu gewährleisten.

Datenverfügbarkeit

Die für diese Studie generierten Datensätze stehen auf Anfrage dem entsprechenden Autor zur Verfügung.

Autorenbeiträge

AP und EK entwarfen die Studie, interpretierten die Ergebnisse und schrieben das Manuskript. AP, LS, TD und PS führten NGS-Analysen durch. TP sammelte die Patientenproben und klinischen Daten. MV führte bioinformatische Analysen durch und schrieb den Rechnercode. TN vorbereitete Webanwendung., Alle Autoren lesen und genehmigt die endgültige Version des Manuskripts.

Förderung

Fördermittel: MZ CR VES16-32339A, zum Teil vom MH CZ-DRO (FNOl, 00098892).

Interessenkonflikterklärung

Die Autoren erklären, dass die Untersuchung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Anerkennungen

Wir entschuldigen uns bei den vielen Autoren, deren Artikel aufgrund von Referenzgrenzen nicht zitiert werden konnten.,

Supplementary Material

18. Smith T, Heger A, Sudbery I. UMI-tools: Modellierung von Sequenzierungsfehlern in eindeutigen molekularen Identifikatoren zur Verbesserung der Quantifizierungsgenauigkeit. Genome Res. (2017) 27:491-9. doi: 10.1101/gr.209601.,116

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