LABORDIAGNOSTIK VON HÄMOGLOBINOPATHIEN
Die primäre Untersuchung einer Hämoglobinopathie sollte ein Vollblutbild, peripheren Blutfilm und Hämoglobinelektrophorese (siehe Abb. 29.4). Das vollständige Blutbild ermöglicht die Beurteilung der Hämoglobinbildung, gemessen an den roten Zellindizes, dem mittleren Zellvolumen (MCV) und dem mittleren Hämoglobin (MCH)., Mikrozytose (MCV < 76 fL) und Hypochromie (MCH < 27 pg) angesichts einer normalen oder erhöhten Anzahl roter Blutkörperchen (> 5,5 × 1012/L) Bei einem eisenrepleten Patienten schlagen Sie eine Diagnose einer Thalassämie vor. Bei β-Thalassämie major oder Intermedia ist dies mit einem signifikanten Grad an Anämie verbunden, während bei Thalassämie-Merkmalen das Hämoglobin normalerweise normal oder nur geringfügig reduziert ist. Die Untersuchung eines mit einer Giemsa-Methode gefärbten Blutfilms kann hilfreich sein, um die Diagnose zu bestätigen., Die endgültige Diagnose beruht jedoch häufig auf der elektrophoretischen oder chromatographischen Analyse von Hämoglobin in Hämolysaten roter Zellen. Die Celluloseacetatelektrophorese bei alkalischem pH-Wert (8,9–9,1) ist die am weitesten verbreitete Methode, da sie einfach, schnell, kostengünstig und wirksam bei der Trennung der üblichen Hämoglobinvarianten ist. Bei homozygoter Sichelzellanämie überwiegt HbS. Eine variable Menge an HbF ist vorhanden, wobei höhere Anteile (> 10%) im Allgemeinen mit einem milderen klinischen Verlauf verbunden sind. Die Hämoglobinkonzentration A2 ist normalerweise normal.,
Löslichkeitstests basierend auf der reduzierten Löslichkeit von Desoxy-HbS in Gegenwart von Reduktionsmitteln, beispielsweise Natriumdithionit, spielen bei der Diagnose von Sichelzellerkrankungen eine begrenzte Rolle, da sie die homozygoten Erkrankungen und Trägerzustände nicht differenzieren. In einer Notsituation weist ein positiver Löslichkeitstest in Verbindung mit einem signifikant reduzierten Hämoglobin und einer typischen Morphologie der roten Blutkörperchen stark auf die Diagnose einer Sichelzellenerkrankung hin. Dies sollte durch Hämoglobinanalyse frühestmöglich bestätigt werden., Mehrere andere Varianten, einschließlich HbD, HbG und Hb Lepore, weisen eine elektrophoretische Mobilität auf, die mit der von HbS auf Celluloseacetat identisch ist, können jedoch durch den negativen Sichellöslichkeitstest und die Citrat-Agar-Gel-Elektrophorese bei saurem pH-Wert (6,0) unterschieden werden. In ähnlicher Weise können Hämoglobine C, E und O, die bei alkalischem pH-Wert auf Celluloseacetat co-migrieren, durch Citrat-Agar-Elektrophorese differenziert werden. Sowohl HBe als auch Hb Lepore sind mit thalassämischen roten Zellindizes assoziiert, was ihre Unterscheidung von elektrophoretisch ähnlichen Varianten weiter erleichtert., Die isoelektrische Fokussierung verbessert die Auflösung einiger Strukturvarianten und kann auch für das neonatale Screening von Eluaten aus Guthrie-Karten (getrockneter Blutfleck) verwendet werden, da sie die Interferenz durch in solchen Proben vorhandenes Methämoglobin verringert.
Die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ist eine schnelle und empfindliche Methode zur Trennung und Quantifizierung von Hämoglobinen, die in einigen Fällen die Identifizierung von Varianten ermöglicht, die mit anderen Techniken nicht möglich sind., Da es weitgehend automatisiert ist und winzige Probenmengen erfordert, ist HPLC die Methode der Wahl für groß angelegte Populationstests wie neonatale Screening-Programme. In den USA und England wird seit einiger Zeit ein universelles Neugeborenen-Screening auf Sichelzellenkrankheiten eingesetzt, und ähnliche Programme werden in anderen europäischen, nahöstlichen und afrikanischen Ländern eingeführt, abhängig von der Prävalenz der Bedingungen und den verfügbaren Ressourcen., Solche Programme haben zu erheblichen Vorteilen in Bezug auf reduzierte Mortalität und Morbidität aufgrund verbesserter Versorgung, frühzeitige Durchführung der Prophylaxe gegen Pneumokokkeninfektionen und elterliche Erziehung geführt. Bei β-Thalassämie variiert der Anteil der einzelnen Hämoglobine mit dem zugrunde liegenden Genotyp. Homozygote β0-Thalassämie ist mit einer Dominanz von HbF, dem Fehlen von HbA und variablen Mengen von HbA2 verbunden (Bereich 1,0–6,0%, Mittelwert 1,7%). Bei Individuen mit homozygoter β+ Thalassämie oder zusammengesetzter heterozygoter β0 / β+ Thalassämie ist eine variable Menge an HbA vorhanden., Hämoglobin F ist erhöht und heterogen unter den roten Zellen verteilt.
Eine genaue Quantifizierung von HbA2 durch HPLC – oder Mikrokolumnenchromatographie ist für die Diagnose eines β-Thalassämie-Merkmals, bei dem der HbA2 erhöht ist, unerlässlich, typischerweise > 3.5%., Träger einer „normalen A2“ – oder „stillen“ β-Thalassämie aufgrund leichter β-Gendefekte oder einer Co-Vererbung einer δ-Genmutation in cis oder trans können mit herkömmlichen Screening-Methoden nicht leicht von α-Thalassämie unterschieden werden und erfordern eine Untersuchung durch spezialisierte Techniken, einschließlich In-vitro-Globinkettensynthese und DNA-Analyse. Die Analyse der synthetischen Verhältnisse der Globinkette durch tritiierten Leucineinbau und Carboxymethylcellulose-Chromatographie ist der endgültige Weg zur Identifizierung von Personen mit Thalassämie, obwohl es wegen seiner mühsamen Natur selten verwendet wird.,
Die α-Thalassämien sind elektrophoretisch durch das Vorhandensein der sich schnell bewegenden Varianten Hb Bart (γ4) und HbH (β4) gekennzeichnet, die bei Neugeborenen am offensichtlichsten sind. In Hydrops fetalis aufgrund homozygoter α0-Thalassämie überwiegt Hb Bart und findet sich in kleineren Mengen in anderen α-Thalassämie-Syndromen in der Neugeborenenperiode. Hämoglobin H kann auch durch Färbung für HbH-Einschlusskörper nachgewiesen werden., Die Diagnose klinisch stiller Formen der α-Thalassämie ist oft eine von Ausgrenzung, die auf der Grundlage der ethnischen Herkunft des Subjekts, der mikrozytären hypochromen roten Zellindizes und einer normalen oder niedrigen HbA2-Konzentration bei normalem Eisenstatus gestellt wird. Eine endgültige Diagnose kann durch DNA-Analyse gestellt werden, die auch häufig α0 und α+ Thalassämie unterscheiden kann.,
Während die Mehrzahl der Hämoglobinopathien durch Hämoglobinelektrophorese diagnostiziert werden kann, können Varianten, die durch Aminosäuresubstitutionen verursacht werden, die die Ladung nicht verändern, wie sie in einigen instabilen Hämoglobinen oder Hämoglobinen mit veränderter Sauerstoffaffinität vorkommen, dem Nachweis entgehen. Weitere Untersuchungen, die in diesem Zusammenhang hilfreich sein können, umfassen die Beurteilung der Hämoglobininstabilität und der Sauerstoffaffinität., Die DNA-Analyse mit hohem Durchsatz hat dies zu einer praktikablen Methode zum Screening auf Globinmutationen in reicheren Ländern gemacht, wobei Techniken wie die multiplexligationsabhängige Sondenamplifikation die Identifizierung großer Genmutationen ermöglichten, die zuvor nur mit Southern Blotting nachweisbar waren. Hämoglobin-Massenspektrometrie kann auch verwendet werden, um abnormale Globine zu identifizieren, indem ihre Masse genau gemessen wird, mit besonderem Potenzial in Screening-Programmen, die bereits Massenspektrometrie verwenden.,
Die Identifizierung von Paaren mit einem Risiko für schwere Hämoglobinopathien durch vorgeburtliches oder vorkonzeptionelles Screening ermöglicht eine fundierte reproduktive Wahl mit der Option einer vorgeburtlichen Diagnose. In den meisten Fällen kann dies nun im ersten Trimester durch Nachweis mutierter Globingene in Chorionzotten-DNA erreicht werden. In mehreren Ländern, insbesondere in Zypern, wo die Trägerrate für β-Thalassämie 12% erreicht, hat dies zu einem deutlichen Rückgang der Geburteninzidenz von Hämoglobinstörungen geführt., Die genetische Präimplantationsdiagnostik wird zunehmend verwendet, um die Auswahl nicht betroffener Embryonen zu ermöglichen, obwohl dies weiterhin ein anspruchsvoller und teurer Prozess ist, der für die meisten Paare nicht anwendbar ist. Versuche entwickeln weiterhin eine nicht-invasive pränatale Diagnostik unter Verwendung von fetalen Zellen und DNA im mütterlichen Blut, obwohl dies derzeit als Routineverfahren für die Hämoglobinopathien technisch nicht machbar ist.
