Good Mood

Bevezető

az új generációs szekvenáló (NGS) rohamosan bővült a klinikai környezetben haemato-onkológiai, illetve onkológiai, mivel lehet, hogy nagy haszonnal jár a diagnózis, a kiválasztás, a kezelés és/vagy prognostication sok betegek (1)., A közelmúltban számos cikket tettek közzé a klinikai onkológiában a mély célzott NGS validációjáról (2, 3), beleértve a molekuláris patológiai Egyesület és az amerikai patológusok Kollégiumának átfogó ajánlását (1). A célzott NGS-módszerek szabványosításának hiánya azonban továbbra is korlátozza azok végrehajtását a klinikai gyakorlatban (4).

az egyik kihívás különösen az alacsony variáns allélfrekvenciákon (VAF) jelen lévő mutációk helyes kimutatása és a szekvenálási lefedettség mélységének szabványosítása (1, 5, 6)., Ez különösen fontos a szubklonális frekvenciákon (1) klinikai hatással rendelkező mutációk esetében, mint például a TP53 génmutációk (tp53mut) esetében a krónikus limfocitikus leukémiában (CLL) (7, 8). A TP53 aberrációk (TP53mut és/vagy kromoszóma 17P deléció) a CLL (9) kezelési döntéseit meghatározó legerősebb prognosztikai és prediktív markerek közé tartoznak., Napjainkban a krónikus limfocitikus leukémia Európai Kutatási kezdeményezése (ERIC) azt javasolja, hogy a tp53mut-ot legalább 10% VAF (10) kimutatási határértékkel (lod) detektálják, és egyre több bizonyíték áll rendelkezésre a kis TP53 mutált alklonok klinikai hatásának szentelt CLL-ben (7, 8).

a Sanger szekvenálás és a mélyreható célzott NGS jelenleg a tp53mut analízis (10), valamint más, alacsony allélfrekvenciájú klinikai hatásokkal rendelkező gének elemzésére használt technikák., Bár a Sanger szekvenálás viszonylag hozzáférhető szekvenálási megközelítést biztosít, hiányzik az alklonok észleléséhez szükséges érzékenység a mutált allélok 10-20% – ának (10) kimutatási határa miatt. Az NGS-alapú analízis így kiemelt szerepet kapott a szomatikus változatok kimutatására szolgáló diagnosztikai laboratóriumokban, valamint a hibajavítási stratégiák különböző technikai fejlesztéseit-mind számítási, mind kísérleti-fejlesztik az alacsony szintű genetikai variációk pontos azonosítására (11)., Ezért foglalkozunk a szekvenálási mélység helyes meghatározásának fontosságával a diagnosztikai NGS-ben annak érdekében, hogy magabiztos és reprodukálható detektálást érjünk el, nem csak az alacsony VAF variánsok esetében. Végül elvégeztünk egy hígítási kísérletet, hogy megerősítsük elméleti számításainkat, majd a TP53MUT diagnosztikai detektálásával kapcsolatos tapasztalatainkat CLL-es betegekben, valamint az NGS szabványosításával kapcsolatos további perspektívákat a rákdiagnosztikában.,

NGS Szekvenálás Mélység Hibaarány

NGS szekvenálás mélység közvetlenül érinti a reprodukálhatóság a változat érzékelés: a magasabb számú igazított sorrendben olvassa, annál nagyobb a bizalom, hogy a bázis hívás egy adott helyzetben, függetlenül attól, hogy a bázis hívja ugyanaz, mint a referencia-bázis, vagy mutáns (1). Más szavakkal, az egyéni szekvenálási hiba olvasása statisztikailag irreleváns, ha a helyes olvasás meghaladja őket., Így a kívánt lefedettségi mélységet a tervezett LOD, a hamis pozitív vagy hamis negatív eredmények tűrése, valamint a szekvenálás hibaaránya (1, 11) alapján kell meghatározni.

binomiális eloszlás alkalmazásával kiszámítható a hamis pozitív és hamis negatív eredmények valószínűsége egy adott hibaarány, valamint a tervezett LOD esetében, és becsülhető egy adott mélységet igénylő változat küszöbértéke (1)., Például 1% – os szekvenálási hibaarány, 10% – os mutáns allélterhelés és 250-es lefedettség mélysége alapján a 9 vagy annál kevesebb mutált olvasás észlelésének valószínűsége a binomiális eloszlás szerint 0,01%. Ezért a 10 vagy több mutált olvasás észlelésének valószínűsége 99,99% (100-0, 01%), és meghatározható a variánshívás küszöbértéke. Más szóval, a lefedettség mélysége 250 a küszöb legalább 10 mutált olvasás lesz a 99.,99% annak a valószínűsége, hogy a mutáns allélterhelés 10% – át nem hagyja ki a variánshívás (bár más arányban kimutatható). Ily módon a hamis negatív eredmény kockázata nagymértékben minimálisra csökken. Másrészt a hamis pozitívok valószínűsége nagymértékben függ a szekvenálási hiba sebességétől (mivel az összes analitikai mérés pontossága a jel-zaj aránytól függ) (1, 11). Példánkban a hamis pozitív eredmény valószínűsége 0,025%; azonban a hamis pozitívok aránya nem elhanyagolható, ha a LOD-t a hibaarány közelében lévő értékre csökkenti., A hagyományos intrinsic NGS hibaarányok 0,1 és 1% között mozognak (Phred minőségi pontszám 20-30) (1, 11) a szekvenálási platformtól, a célrégiók GC-tartalmától (12) és a töredék hosszától függően, amint azt az Illumina párosított végszekvenálás (13) mutatja. Ezért a VAFs <2% változatok kimutatását a hamis pozitív eredmény nagy kockázata befolyásolja, függetlenül a lefedettség mélységétől., Fontos megemlíteni azt is, hogy a szekvenálási hibaarány csak a szekvenálás által előidézett hibákra vonatkozik, és nem foglalja magában a DNS-feldolgozás és a könyvtár előkészítése során bevezetett egyéb hibákat, különösen az amplifikációs lépések során, amelyek tovább növelik a hibaarányt (1, 11).

minimális szekvenálási lefedettség a klinikai beállításokban

jelenleg nincs egyetértés a klinikai környezetben a minimálisan szükséges lefedettséggel kapcsolatban az NGS által végzett mély célzott resequencing alkalmazásával, ezért minden laboratóriumnak meg kell határoznia saját paramétereit a megfelelő minőség elérése érdekében (1, 5)., A mai napig csak néhány tanulmány azt javasolta, hogy a minimális lefedettség kritériumai mély célzott NGS a klinikai onkológia: 500 mélység lefedettség, valamint egy LOD 5% – a (2), 300-500 mélysége fedezet nélkül dacolva a LOD (3), 250 mélység, valamint egy LOD 5% – os küszöb beállítása 1000 mélysége lefedettség szükséges esetekben heterogén változatok alacsony daganat cellularity minták (1), illetve 100 mélysége legalább 10 változat olvas egy LOD 10% – os (10)., A binominális adateloszlás szerint a 250-es lefedettségi mélységnek valóban elegendőnek kell lennie az 5% – os VAF kimutatására, a ≥5 értéket támogató variáns küszöbértékével (1.ábra). Másrészt az 100 lefedettségi mélységű NGS-elemzés, valamint az ERIC konzorcium által ajánlott legalább 10 variáns-támogató követelmény (10) 45% – os hamis negatív eredményt eredményezne a 10% – os LOD-val rendelkező minták esetében., Ezen elméleti számítások megerősítéséhez két független hígítási kísérletet végeztünk a TP53 NGS analízis teljesítményének becslésére, hogy 10% VAF-ot észleljünk 100 olvasás mélységben. Valójában a hamis negatívok 30%-át (7 valódi pozitív mintából 5 pozitív mintát, 13 valódi pozitív mintából 9 pozitív mintát) észleltük két független szekvenálási folyamatban. Sajnos a hamis negatív arányt gyakran alábecsülik a célzott újraszabályozásban., Is, egy friss tanulmány vizsgáló laboratóriumok eredményei szomatikus változat érzékelés a VAFs között 15, 50% 111 laboratóriumban jelentett LODs az 5-15% (6) azt mutatja, hogy jelentős hibát a diagnosztikai NGS merülhet fel a hamis negatív eredményt, még a minták magas mutáció terhelés (6). Három egyidejű hamis pozitív eredmény közül az összes változatot helyesen detektálták, de rosszul jellemezték (6)., Mivel a laboratóriumokat nem kérték fel arra, hogy jelentsék a lefedettség mélységét más régiókban, mint az azonosított változatok (6), csak azt feltételezhetjük, hogy az alacsony lefedettség vagy a magas variánshívási küszöbértékek hozzájárultak a hamis negatív eredményekhez. Ezek az eredmények arra is rávilágítanak, hogy szükség van a szabványosított lefedettség mélység paraméterek diagnosztikai NGS, figyelembe véve a szekvenálási hibák, valamint a vizsgálati-specifikus hibák.

Gyakorisága TP53 Subclonal Mutációk CLL Észlelt Keresztül Diagnosztikai NGS

annak érdekében, hogy értékelje az előfordulása alacsony VAF valós világ beállítások, megnéztük a kohorsz CLL betegek megvizsgálta a TP53mut a diagnosztikai laboratórium. A tp53mut-ot a korábban jelentett értékeknek megfelelően értékelték (14, 15). Röviden, TP53 (exons 2-10 beleértve 2 bp intronic átfedés, 5′ és 3 ‘ UTR) elemeztük segítségével 100 ng gDNA per reakció., Az Amplicon-alapú könyvtárakat a MiSeq (2×151, Illumina) páros végeként szekvenálták, minimális cél olvasási mélysége 5000 x. a TP53mut LOD-ját 1% – ra állították be, az 1-3% tartományban lévő változatokat pedig replikációval erősítették meg. A Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően beiratkozott betegek írásbeli beleegyezését kapták, a tanulmányt a helyi Etikai Bizottság hagyta jóvá.

a 859 CLL-es beteg diagnosztikai kohorszának (2016.április–2019. április) 25% – a (215/859) pozitív volt a TP53mut esetében, és ezek közül 52,6% (113/215) 10% – os vagy annál alacsonyabb VAF-os variánsokat szállított., Megfigyeléseinkkel összhangban egy nemrégiben készült tanulmány (8) 63, illetve 84% – os alacsony teher (Sanger negatív) TP53MUT jelenlétéről számolt be CLL-ben szenvedő betegeknél a diagnózis idején, illetve a kezelés idején, és megerősítette a TP53 teljes túlélésére gyakorolt negatív hatást a kezelés idején 1% VAF felett (8).,

Számológép Diagnosztikai NGS Beállítások Észlelése Subclonal Mutációk

ahhoz, Hogy segítse a laboratóriumok a meghatározása a minimális megfelelő lefedettség paraméterek, mi biztosítunk egy egyszerű, felhasználóbarát elméleti számológép (szoftver) alapján a binomiális eloszlás (2. Ábra), le a Kiegészítő Fájl. Egy webes (vagy asztali) alkalmazás és önálló forráskódok R-ben elérhetők a Githubon: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., A számológép segítségével könnyen meghatározhatók a szekvenálási mélység megfelelő paraméterei, valamint az adott szekvenálási hibaarány és a tervezett lod megfelelő minimális variánsszáma. Ezenkívül a felhasználók más hibákat is figyelembe vehetnek azáltal, hogy egyszerűen hozzáadják a tesztspecifikus hibákat a szekvenálási hibaarányhoz, és ezt az általános hibát használják a számológép bemeneteként. Például a TP53 mutációs analízis esetében ~1,16% – os általános hibával számítottuk ki, így a minimális lefedettségi mélységi követelményeket 2000-re állítottuk be, minimális küszöbértékkel 40 olvasás 3% VAF esetén.,

a Vita

Bár diagnosztikai NGS szerzett előtérbe, a klinikai beállítások értékeléséhez szomatikus mutációk rák, elégtelen szabványügyi a szekvenálás paraméterek még mindig korlátozza a végrehajtást, a klinikai gyakorlatban (1), elsősorban a változatok jelenlegi alacsony allél gyakorisága (4). Ezért foglalkozott a technikai kérdés helyesen meghatározó a sorozatot, mélység diagnosztikai NGS annak érdekében, hogy magabiztos, reprodukálható észlelések alacsony VAF változatok., Különösen elméleti számításokat végeztünk annak érdekében, hogy meghatározzuk a lefedettség optimális mélységét az alacsony allélfrekvenciájú változatok észlelésének kívánt valószínűségére, figyelembe véve a szekvenálási hibaarányt. Ezen túlmenően ezeket az elméleti számításokat hígítási kísérletek elvégzésével erősítettük meg. Ezen megfigyelések alapján azt javasoljuk, hogy a lefedettség mélysége 1,650 vagy magasabb (a megfelelő küszöbértékkel együtt legalább 30 mutált olvasás), hogy ≥3% variánsokat hívjunk fel a variáns detektálás 99,9% – os valószínűségének eléréséhez, csak a hagyományos NGS szekvenálási hiba alkalmazásával., Az 1-3% VAF tartományban lévő változatok csak akkor hívhatók meg, ha a kapott szekvenciaadatok kiváló minőségűek (átlagos Q30 > 90%) és/vagy ha a változatokat replikációval vagy ortogonális módszerrel (1, 11, 16) megerősítik. Egy egyszerű, felhasználóbarát elméleti számológépet (szoftvert) is biztosítunk, amely segít a laboratóriumoknak a megfelelő szekvenálási mélység megoldásában, valamint a megfelelő minimális számú variáns olvasásában, figyelembe véve a szekvenálási hibaarányt. Az egyszerű számológép segíthet minimalizálni a hamis pozitív, hamis negatív eredményeket diagnosztikai NGS.,

mindazonáltal a helyes szekvenálási mélységet a vizsgálatspecifikus tényezők is befolyásolják (1). A DNS-feldolgozás és a könyvtárkészítés során számos szakaszban előfordulhatnak hibák. A leggyakoribbak az NGS könyvtár előkészítése során bevezetett erősítési hibák (1, 12, 17). A hibák egyéb gyakori forrása a könyvtári komplexitás (az elemzett független DNS-molekulák száma), a DNS minősége, a célrégió összetettsége stb. Minden lehetséges tesztspecifikus hibát teszttervezéssel, módszerellenőrzéssel és minőségellenőrzéssel kell orvosolni.,

jelenleg kialakulóban vannak a hibajavítási stratégiák, mind számítási, mind kísérleti jellegűek, hogy enyhítsék a diagnosztikai NGS (11) magas hibaarányait. Eddig a legígéretesebb hibajavítási módszerek közé tartozik az UMI (egyedi molekuláris azonosítók), amelyek korrigálják a PCR hibákat (18), valamint a jel-zaj korrekciós megközelítések (11). Ezek az előrelépések megpróbálják csökkenteni a LOD-t, ezáltal növelve az NGS diagnózis jövőbeli lehetőségeihez szükséges szekvenálási pontosságot.,

a diagnosztikai NGS szabványosításának javítása érdekében a helyes lefedettségi mélység becslése ajánlott kiindulási pont az adott NGS-vizsgálatot körülvevő küszöbértékek értékelésekor. Mindazonáltal továbbra sem áll rendelkezésre a minimális műszaki követelményekre és az NGS-ben való jelentésére vonatkozó, közzétett útmutatás, ami különösen fontos a rákdiagnosztika klonális és szubklonális mutációinak kimutatásában., Ez elsősorban a könyvtár-előkészítési megközelítések széles skálájának, valamint számos változónak köszönhető, amelyek szerepet játszanak az egyes NGS-vizsgálatokban, amelyeket nehéz szabványosítani, a laboratóriumok közötti változékonysággal együtt. Ezért nagyon kívánatos a minimális műszaki követelmények meghatározása és az NGS-ben történő jelentése., Tapasztalataink alapján a diagnosztikai NGS a haemato-onkológiai, javasoljuk, hogy a jelentés legalább az alábbi műszaki paraméterek: LOD, általános hiba NGS assay (vagy legalább szekvenálás hibaarány), a mennyiségű DNS-bemenet, forrás, minőségét, DNS, minimális lefedettség mélység, valamint a százalékos célzott bázisok szekvenált ez a minimális mélység, teljes számú célpont olvassa kiterjedő változata régió száma olvassa támogató változata. Különös hangsúlyt kell fektetni a formalin-fix paraffin-beágyazott (FFPE) minták NGS szabványosítására (19, 20).,

együttesen tanulmányunk rávilágít a helyes szekvenálási mélység fontosságára, valamint a minimális számú olvasásra, amely az alacsony VAF-os változatok megbízható és reprodukálható felismeréséhez szükséges a diagnosztikai NGS-ben. Egy adott hibaarány helyes szekvenálási mélységének kiszámítása felhasználóbarát elméleti számológépünk (szoftver) segítségével segíthet minimalizálni a hamis pozitív és hamis negatív eredményeket a diagnosztikai NGS-ben, többek között a szubklonális mutációkhoz kapcsolódó helyzetekben., A diagnosztikai ng-kre vonatkozó szigorú vizsgálati és szabványosított minimumkövetelmények különösen kívánatosak a helyes eredmények biztosítása érdekében a klinikai beállításokban.

rendelkezésre álló adatok

a tanulmányhoz létrehozott adatkészletek ésszerű kérésre elérhetők a megfelelő szerző számára.

szerző

AP és EK tervezték a tanulmányt, értelmezték az eredményeket, és megírták a kéziratot. Az AP, az LS, a TD és a PS NGS elemzést végzett. A TP összegyűjtötte a betegmintákat és a klinikai adatokat. Az MV bioinformatikai elemzést végzett, majd megírta a számológép kódját. TN készített webes alkalmazás., Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a kézirat végleges változatát.

finanszírozás

Támogatási támogatás: MZ CR VES16-32339a, részben az MH CZ—DRO (FNOL, 00098892).

összeférhetetlenségi nyilatkozat

a szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.

elismerések

elnézést kérünk a sok szerzőtől, akiknek cikkeit a referenciakorlátok miatt nem lehetett idézni.,

Supplementary Material