Obiettivi
- acquisire familiarità con la speciazione del genere Staphylococcus.
- Crescere e identificare diverse specie di stafilococchi utilizzando agar selettivo e differenziale
- Identificare i 3 tipi emolitici su agar sangue.,
Staphylococcus è un genere di cocchi Gram +, non perforanti appartenenti alla famiglia Micrococcaceae che si trovano spesso come normale microbiota umano della pelle e della cavità nasale. Ci sono cinque organismi da considerare come potenziali patogeni umani in questo genere: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophiticus, S. haemolyticus e S. hominis, ma i primi tre sono gli isolati più comuni. S. aureus è spesso considerato il più problematico dei tre agenti patogeni e si distingue dagli altri due per essere l’unico in grado di coagulare il plasma. S., aureoè in grado di causare molte infezioni piogeniche superficiali (che formano pus) del derma e dei tessuti sottostanti, nonché gravi infezioni sistemiche. Può produrre una gamma di tossine tra cui enterotossine (intossicazione alimentare), citotossine (tossine sistemiche generali) e superantigeni da shock tossico. Gli altri stafilococchi coagulasi-negativi (S. epidermidis e S. saprophiticus) sono molto meno frequentemente trovati come agenti patogeni, ma sono occasionalmente associati a endocardite,infezioni articolari protesiche e infezioni della ferita, solo per citarne alcuni.,
Questo esercizio ti dà l’opportunità di utilizzare mezzi selettivi, in questo caso a base di cloruro di sodio elevato (MSA e SM1 10 sono entrambi mezzi selettivi per l’isolamento degli stafilococchi – 7,5% NaCl). Un mezzo selettivo ha un agente inibitorio che favorisce la crescita di alcuni batteri inibendo altri. MSA contiene un indicatore aggiuntivo per il monitoraggio della fermentazione del mannitolo, che lo rende anche un mezzo differenziale., Tra i batteri che possono crescere in presenza di NaCl elevato, alcuni sono alofili (che richiedono una certa concentrazione di sale per crescere) mentre altri sono alodurici (non usare il sale, ma può tollerarlo). Stafilococco non è alofilo, ma piuttosto alodurico, in quanto può vivere o sopportare alte concentrazioni di NaCl. L’alto contenuto di sale in SM1 10 e MSA inibisce altri microrganismi comuni della pelle. Gli altri mezzi utilizzati in questo esercizio sono per differenziare lo stafilococco patogeno da quello non patogeno e per l’identificazione della specie.,
Non solo resistente al sale, lo stafilococco è sempre facoltativamente anaerobico. Una volta macchiato, sarà visto in piccoli cluster (staphylo = cluster). Lo stafilococco è solitamente beta emolitico o non emolitico (chiamato emolisi gamma). Gli stafilococchi patogeni possono produrre una varietà di fattori di virulenza, tra cui tossine,coagulasi, leucocidine ed enzimi idrolitici che possono danneggiare i tessuti ospiti.
Agar sangue (BAP) è fatto con il 5% di sangue di pecora. È un mezzo comune utilizzato per la coltura di batteri perché:
- È un grande mezzo di arricchimento per i batteri fastidiosi.,
- L’emolisi delle cellule del sangue può essere molto utile come test di identificazione.
L’agar CNA è un tipo di agar del sangue. L’unica differenza è che la CNA ha un antibiotico, l’acido naladixico, che inibisce i gram – batteri.
L’emolisi è la rottura dei globuli rossi. Le emolisine sono enzimi prodotti da alcuni batteri e vengono rilasciati nel mezzo intorno alla colonia batterica. Può essere una rottura completa delle cellule, con il rilascio di emoglobina e una compensazione del rosso dal mezzo circostante intorno alla colonia., Oppure l’emolisi può essere una rottura parziale, con conseguente zona verdastra o verde-gialla intorno alla colonia.,i>
SCHEMATICA DELLA PROCEDURA di IDENTIFICAZIONE
1 ° sessione ⇒ 2a sessione ⇒ 3 ° sessione ⇒ 4 ° sessione
CNA Dnasi Coagulasi Eseguire altri test necessari a Identificare le specie
MSA SM110 ONPG
Ossidasi, Catalasi
Grammo rosso Fenolo lattosio
Macchia Brodo
LE PROCEDURE
Nota
Essere sicuri di mantenere un elenco di tutti i risultati del test per il tuo isolati.,
1a sessione
- Ad ogni tabella verrà assegnata una specie stafilococcica che cresce su piastra aNA o TSA.
- Utilizzando una tecnica di striscia di isolamento, inoculare l’acido naladixico Columbia (CNA) e posizionare il disco di novobiocina nella sezione 1.
- La sensibilità di Novobiocin è una caratteristica di differenziazione chiave fra alcune delle specie dello stafilococco. Posizionare le pinze nell’alcool e quindi sterilizzare le pinze facendole passare rapidamente attraverso la fiamma. L’alcol prenderà fuoco e una volta evaporato dalla pinza, sarà quindi sterile., Ora puoi scegliere un disco novobiocin dal supporto da posizionare sulla piastra CNA—nella PRIMA sezione della striscia (dove ci sarà una crescita confluente del batterio).
- Per le altre piastre di agar-SM 110 piastra, mannitolo sale agar (MSA) piastra, DNasi agar piastra – una linea di inoculazione lungo il centro della piastra è adeguata per i risultati di crescita.
- Incubare i terreni a 37°C.
- Eseguire test di ossidasi e catalasi su colture di piastre.
- Gram macchia l’isolato per ottenere forma e disposizione così come la reazione di gram.
- Faremo il test ONPG la prossima sessione., Questo test richiede l’accensione di un insieme di geni, l’operone lac. Per indurre questa attività, il batterio deve essere esposto al lattosio. Questo è il motivo per cui inoculerai anche un tubo di brodo di lattosio rosso fenolo.
2a sessione
- Vai ai singoli esercizi di laboratorio per interpretare il test del sale di mannitolo e della DNasi (richiede HCl).
- Sulla piastra CNA, stai controllando 2 reazioni – – – sensibilità all’antibiotico novobiocin E all’emolisi del sangue.,
- Novobiocina sensibilità – Una zona di 17 mm indica la sensibilità
- reazioni Emolitiche :
- alfa (α) emolisi–zona verde intorno a colonia, causato da perdite di emoglobina convertito in biliverdina, chiamato un parziale di emolisi
- beta (β) emolisi–rimozione completa intorno colonia causato da un guasto di globuli Rossi da streptolysin enzimi
- gamma (γ) emolisi – no hemolysins, nessuna zona
- specie di Staphylococcus sono o beta emolitici o gamma (non emolitica)., Lo stafilococco aureo produce la tossina alfa che causa tipicamente ampie zone di emolisi beta (completa).
- Controllare il SM 110 per la crescita e per il pigmento. Le sostanze nutrienti e le vitamine in questo mezzo migliorano la pigmentazione dello stafilococco patogeno, quelle colonie che diventano una colonia giallo-arancio.
- Eseguire il test coagulasi: c’è un esercizio collegato per questo test. Ci sono solo alcune specie di stafilococco che sono positive per il test della coagulasi (vedi tabella sotto) e S. aureus è il più comune., Poiché ci sono 2 generi di enzima-legato e libero della coagulasi – – – ci sono 2 prove differenti che possono essere usate per identificare questi enzimi. Il metodo del TUBO è il test definitivo del 2, il più affidabile. L’esercizio test coagulasi nel manuale di laboratorio descrive chiaramente queste 2 versioni.
- Verrà eseguito il test ONPG. Guarda nei tuoi esercizi di laboratorio per questo test per le indicazioni su come eseguire il test. Poiché c ‘ è molto poco liquido nel tubo, si vuole coprire la parte superiore del tubo sarà parafilm e poi posizionare la parte superiore del tubo sopra che. Questo riduce la disidratazione.,
3a sessione
- La principale reazione di prova da utilizzare nell’identificazione dello stafilococco è la reazione di prova della coagulasi, che divide il genere Staphylococcus in 2 gruppi—specie coagulasi negative e specie coagulasi positive. Il supporto di prova che verrà eseguito per l’identificazione dipende dalla categoria in cui rientra il tuo organismo. Si consiglia di eseguire alcuni dei seguenti test.,
- Available media:
- arginine and ornithine
- decarboxylase broths
- urea broth
- ONPG
- sucrose, trehalose, maltose sugars
- VP broth
- nitrate broth
- If you have a coagulase positive Staph, there are only a few species available as your choice: there is a table with those species below.,
- Se il vostro organismo è coagulasi negativo, controllare il diagramma di flusso qui sotto, così come il manuale di Bergey o altri libri di identificazione.
- Eseguire i test necessari per l’identificazione. SPETTA A TE DETERMINARE QUALI TEST EXTRA ESEGUIRE PER UNA CHIARA IDENTIFICAZIONE.
4a sessione
- Leggi tutti i test dell’ultima sessione (vedi esercizi di laboratorio per informazioni sulle interpretazioni dei test.
- Scrivi un rapporto per l’identificazione delle specie di stafilococco, se il tuo istruttore ti indirizza a farlo.,
| Tube coagulase | Acid from trehalose | VP test | ONPG test | |
| S. aureus | + | + | + | – |
| S. intermedius | + | + | – | + |
| S., hyicus | variable | + | – | – |
| S. schleiferi | + | – | + | ? |
Common coagulase negative Staphylococcal species
| S. aureus | S. epidermidis | S. saprophiticus | |
| Alpha toxin (ß-hemolysis) | + (most strains) | – | – |
| Growth on 7.,acace93570″>DNase production | + (usually) | – | – |
| Sensitivity to novobiocin | sensitive | sensitive | resistant |
* Novobiocin sensitivity = >17mm zone size
QUESTIONS
- Which type of hemolysis is often associated with pathogenicity?,
- Quali sono le caratteristiche distintive del genere Staphylococcus?
- Puoi dare la reazione di prova di S. aureus per ciascuno dei principali test eseguiti – – – MSA, SM110, coagulasi, catalasi, ossidasi e DNasi?
- Cosa succede ai globuli rossi nell’emolisi beta e alfa?
Contributori e attribuzioni
-
Jackie Reynolds, Professore di biologia (Richland College)
