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Effetto di rbST sulla produzione di latte

la Tabella 2 mostra, in sintesi, di produzione di latte per il rbST e gruppi di controllo espressi come media e deviazione standard della produzione di latte (Kg / giorno) in corrispondenza di ogni ciclo di trattamento, così come la produzione differenza tra i due gruppi (% del latte prodotto da rbST gruppo rispetto agli animali di controllo)., Dal ciclo 0 al ciclo 3, la produzione di latte sembra aumentare in entrambi i gruppi, indicando forse che gli animali non avevano ancora raggiunto il loro picco di allattamento. Sebbene la prima dose di rbST sia stata somministrata circa 2 mesi dopo il parto, come raccomandato dal produttore, è importante notare che questa raccomandazione si basa su modelli matematici che individuano il picco di produzione di latte a 60-90 giorni dopo il parto., Tuttavia, questi modelli sono solo approcci teorici e i giorni nel latte (DIM) al picco del latte presentano un’ampia variazione tra mandrie e vacche, essendo condizionati, tra gli altri fattori, dal benessere e dall’alimentazione37. Dal ciclo 4 alla fine dello studio, si è intravista una diminuzione della produzione di latte delle vacche di controllo mentre gli animali trattati con rbST sembravano mantenere la loro produzione relativamente costante su una media di 30-35 kg di latte al giorno, mostrando un’evidente tendenza al ribasso solo quando il trattamento ormonale è stato interrotto (cicli 14, 15 e 16)., A questo punto, le differenze di produzione osservate tra i gruppi sono tornate a livelli molto vicini a quelli osservati al ciclo 0. È notevole il fatto che la produzione di latte è stata significativamente più elevata nel gruppo rbST rispetto al controllo durante l’intero studio, tranne durante il ciclo 6 quando questi animali producevano solo il 5% in più rispetto ai soggetti di controllo (Tabella 2). Sulla base del modello di somministrazione bisettimanale di rbST raccomandato dal produttore, il giorno 70 il gruppo di animali trattati dovrebbe aver ricevuto una nuova dose di ormone della crescita ricombinante., Tuttavia, tale dose non è stata applicata in modo da poter valutare se il gruppo rbST potesse recuperare il profilo trascrizionale pre-dose dopo 28 giorni senza somministrazione ormonale (Fig. 1). Probabilmente a causa di questa mancanza di ormone, le differenze statisticamente significative esistenti nella produzione di latte tra i due gruppi sono scomparse, evidenziando gli effetti dell’rbST sui tassi di produzione di latte (Tabella 2). Al giorno 84, rbST è stato nuovamente somministrato e le differenze significative nella produzione di latte tra i due gruppi sono riapparse (24%)., Al ciclo 12 è stata osservata una differenza massima del 43% in più di latte negli animali trattati rispetto alle vacche di controllo, sia in relazione a una produzione mantenuta a causa della rbST che a un andamento naturale decrescente nelle femmine di controllo. Curiosamente, queste differenze significative sono state mantenute fino alla fine dello studio, anche quasi due mesi dopo la somministrazione dell’ultima dose (12a dose, giorno 168) (Tabella 2).

Isolamento dell’RNA dalle cellule somatiche bovine

Le MSC sono fonti di RNA facili da raccogliere per gli studi di espressione genica, in quanto queste cellule possono essere isolate dal latte crudo seguendo un protocollo molto semplice. Inoltre, la raccolta dei campioni è economica e non invasiva, poiché il latte può essere raccolto nella sala di mungitura senza contatto diretto con l’animale e quindi senza causare stress ad esso che potrebbero alterare i risultati ottenuti. In questo studio, il trattamento con rbST non ha avuto effetti significativi (P = 0.,099) sulla quantità di RNA isolato da MSC, con una concentrazione media di 120,69 ± 68,31 µg mL-1 nei campioni del gruppo rbST e 132,36 ± 68,86 µg mL-1 nei campioni del gruppo di controllo. Il valore medio del rapporto A260 / 280 era 1,766 ± 0,095. È possibile che una fase di purificazione con colonne di spin abbia aumentato il rapporto A260/280 e quindi la purezza dei campioni di RNA. Sebbene l’inclusione di questo passaggio aumenti il prezzo del campione nell’analisi di routine, consente di ottenere campioni con maggiore purezza. Il valore medio di RIN osservato per i campioni analizzati è stato di 6,88 ± 0.,82 Alcuni fattori potrebbero influire sull’integrità dei campioni. I campioni utilizzati in questo studio erano cellule somatiche bovine isolate dal latte. Il latte è caratterizzato da un microbiota complesso e gli RNasi derivati da quel microbiota potrebbero essere responsabili di una minore integrità dell’RNA. Inoltre, alcune delle cellule somatiche presenti nel latte potrebbero essere parzialmente degradate. Questi fatti sono stati osservati anche in uno studio che ha utilizzato lo striscio vaginale bovino per studi di trascrittomica con l’obiettivo di trovare biomarcatori per tracciare l’abuso di agenti anabolici38., Inoltre, il processo di mungitura, raccolta del latte e trasporto al laboratorio potrebbe, nonostante sia effettuato con il più rapidamente possibile, influenzare l’integrità dell’RNA.

Effetto di rbST sui geni dell’asse somatotropico

Per la progettazione delle piastre OpenArray® utilizzate in questo studio è stato selezionato un set di 18 geni (Tabella 1). Questa selezione si basava sul potenziale di questi geni di ottenere una caratteristica firma trascrittomica rbST che potrebbe essere utilizzata come standard per controllare l’ab(uso) di rbST nei bovini da latte., Precedenti studi di espressione genica con rbST sono stati concepiti come studi a dose singola e a campionamento singolo nel tessuto mammario post mortem27 o studi multidose (cinque dosi) con campionamento di sangue e muscoli in vivo31. Questi metodi sono considerati invasivi, relativamente costosi e quindi poco pratici ai fini del controllo nelle aziende lattiero-casearie. Nel caso della somatotropina, il controllo deve essere eseguito in vivo, poiché l’obiettivo finale è evitare l’ingresso del latte rbST nel mercato lattiero-caseario.,

In questo studio, l’espressione di IGF-1 è stata rilevata solo in tutti i punti del campione in una mucca (mucca 7) trattata con rbST e non è stata rilevabile nel MSC del gruppo di controllo. Il fatto che fosse possibile individuare soltanto l’obiettivo IGF-1 a tutti i punti del campione in una mucca può indicare l’esistenza delle risposte locali differenti della ghiandola mammaria a RBST esogeno fra gli individui. La maggior parte delle molecole di IGF-1 trovate nella circolazione sono legate con l’alta affinità ad una o più delle sei proteine obbligatorie conosciute IGF-1 (IGFBP-1–6) che modulano la biodisponibilità di IGF-1 in tissues39 dell’obiettivo., Studi precedenti hanno osservato che rbST influenza fortemente l’upregulation di IGFBP-5 nel muscolo scheletrico di cattle31 e downregulates IGFBP-3 in tissue32 mammaria. Tuttavia, in questo studio, le trascrizioni di né IGFBP-3 né IGFBP-5 sono state rilevate in qualsiasi momento. Questo risultato potrebbe essere dovuto al fatto che le MSC sono composte principalmente da leucociti40 in cui l’effetto repressivo dell’IGFBP potrebbe non essere così importante come nel tessuto mammario. Pertanto, sia le proteine leganti IGF-1 che IGF-1 vengono scartate come potenziali marcatori nelle cellule somatiche in questo studio.,

Un altro componente chiave dell’asse somatotropico è il ricevitore IGF-1 (IGF-1R) che è il ricevitore di segnalazione primario per IGF-1 che media la maggior parte dei suoi effetti biologici. Il giorno 1 il gruppo rbST (0.348 ± 0.131) ha avuto un significativamente (P < 0.001) maggiore abbondanza relativa di IGF-1R rispetto al gruppo di controllo (0.0898 ± 0.0486). Diversi studi che hanno valutato la concentrazione di rbST nel sangue dopo la somministrazione hanno osservato che le concentrazioni più elevate di questo ormone ricombinante sono state trovate dopo la somministrazione di rbst14,15., Pertanto, le differenze significative osservate nel gruppo trattato potrebbero essere dovute come risposta all’IGF-1 sintetizzato come risposta alle più alte concentrazioni di rbST nelle vacche trattate dopo la prima somministrazione della dose. In Fig. 2, si può osservare che l’abbondanza relativa di IGF-1R per i due primi cicli di somministrazione rbST era anche significativamente più alta nel gruppo rbST rispetto al gruppo di controllo in molti punti di campionamento. Curiosamente, il giorno 84 dello studio, l’abbondanza relativa di IGF-1R era simile nel gruppo rbST (0,070 ± 0,057) e nel gruppo di controllo (0,110 ± 0,030)., Questo giorno ha coinciso con la sesta somministrazione di rbST, e tra questa dose e la quinta dose c’era un intervallo di 28 giorni invece di 14 giorni. Pertanto, è possibile che il gruppo rbST abbia recuperato il livello fisiologico di IGF-1R dopo diversi giorni senza rbST, mostrando anche effetti di ritiro della down-regulation sulla trascrizione di IGF-1R. Questi risultati indicano che IGF-1R è un buon candidato possibile per l’inclusione in un pannello dei geni per individuare l’uso di rbST nelle aziende lattiero-casearie., Sebbene altri autori non abbiano trovato un effetto significativo di rbST sui livelli di IGF-1R nel muscolo scheletro31, in questo studio è stata osservata una risposta chiara nei livelli di questa trascrizione del recettore in MSC. In questo senso, i leucociti, i neutrofili ed i monociti possono produrre l’ormone della crescita e IGF-1 ed esprimere i loro ricevitori che indicano che le vie di segnalazione IGF-1/IGF-1R potrebbero esercitare le funzioni regolatorie sul sistema immunitario compreso proliferation41,42 immune delle cellule. La differenza tra i due studi potrebbe essere dovuta alle diverse matrici utilizzate., MSCs potrebbe rispondere meglio ai più alti livelli circolanti di IGF-1 e di aumentare il numero di recettori per questa molecola nella membrana

Effetto della rbST sui geni correlati al sistema immunitario

Il fattore di necrosi tumorale (TNF) e l’interleuchina-1β (IL-1β) sono due citochine strettamente correlate al sistema immunitario43., A causa presumibilmente della loro relazione, è stato possibile identificare tendenze simili nell’abbondanza relativa di trascritti TNF e IL-1β durante lo studio. La somministrazione di rbST ha provocato un aumento significativo dell’abbondanza relativa di trascritti TNF e IL-1β. Vale la pena ricordare che nei giorni 9, 23 e 35, le abbondanze relative di TNF e IL-1β erano significativamente più alte nel gruppo rbST rispetto al gruppo di controllo (Fig. 3). Questi giorni corrispondono alla seconda settimana di cicli rbST, circa 7-9 giorni dopo le iniezioni di Lactotropina®., Pertanto, è possibile che i cambiamenti trascrittomici causati da rbST in queste due citochine siano più evidenti nella seconda settimana di un ciclo rbST. Curiosamente, il giorno 84 (28 giorni dopo la 5a somministrazione di rbST), non c’erano differenze significative tra i gruppi (Fig. 3). In questo contesto, altri studi precedenti hanno utilizzato potenti tecnologie trascrittomiche per rilevare l’uso di agenti anabolizzanti in cattle26,38., Questi studi hanno anche osservato un aumento della trascrizione di IL-1β, uno dei quali in modo significativo26, e questo è molto interessante perché lo studio di cui si è fatto riferimento ha utilizzato cellule del sangue la cui composizione è molto simile a quella di MSC, in quanto hanno un’alta percentuale di globuli bianchi. Tuttavia, gli studi precedentemente menzionati non hanno trovato un effetto di agenti anabolizzanti sul TNF, mentre la presente ricerca ha trovato una forte influenza della somministrazione di rbST sull’abbondanza relativa di TNF., A questo proposito, è stato riportato che la somministrazione esogena di rbST durante l’allattamento può migliorare la risposta immunitaria nelle vacche 44. In realtà, la conta delle cellule somatiche del latte è aumentata prima e più velocemente nelle mucche che soffrono di mastite coliforme quando è stata somministrata RBST45. L’ormone della crescita e la sua versione ricombinante mostrano la capacità di modulare la reazione infiammatoria e la difesa dei neutrofili della ghiandola mammaria lattante bovina in salute e vacche malate45. Ciò potrebbe spiegare la sovraregolazione del TNF e del IL-1β nelle vacche trattate con rbST.,

Negli studi di screening utilizzando la trascrittomica è molto difficile trovare un gene specifico che potrebbe essere utilizzato come gene molto fidato. Va notato che sia IL-1β che il TNF possono essere sovraregolati in altri processi come mastite sub-clinica46,47. Diversi studi condotti negli Stati Uniti hanno osservato che le grandi aziende hanno maggiori probabilità di adottare il RBST, suggerendo non solo una componente potenziale dell’uso e della redditività del RBST,ma anche una componente dell’operatore (età e istruzione) 48,49., La somatotropina ricombinante è stata frequentemente riportata come una tecnologia ad alta intensità di gestione, associata all’uso di altre tecnologie orientate alla produttività e pratiche di gestione che sono caratteristiche delle aziende agricole più grandi, essendo meno frequenti tra grazers49,50. In questo senso, la mastite subclinica provoca una riduzione della produzione di latte nelle vacche colpite51. Pertanto, dovrebbe essere interessante combinare i dati dei saggi trascrittomici con i dati sulla produzione di latte., Inoltre potrebbe essere accompagnato da un test microbiologico del latte di vacche sospette per rilevare i principali agenti patogeni associati alla mastite subclinica. Ma ciò che realmente aumenta il potenziale di discriminazione è l’inclusione di più geni nel pannello.

Effetto di rbST sul ciclo cellulare, proliferazione, differenziazione e adesione

È noto che rbST aumenta la sintesi del latte aumentando il turnover (proliferazione/apoptosi) e l’attività delle cellule epiteliali mammarie, indicando che RBST influenza le vie metaboliche che regolano il turnover/ciclo cellulare e il metabolismo52., Il ciclo cellulare è controllato da cicline e chinasi ciclina-dipendenti. Di questi, la ciclina D (endodata dal gene CCND1) coordina la progressione del ciclo cellulare attraverso la stimolazione extracellulare (ad esempio, fattore di crescita, disponibilità di nutrienti) e guida la progressione della fase da G1 a S con conseguente mitosi cellulare. Tuttavia, la maggior parte delle cellule adulte sono mantenute in uno stato di riposo noto come fase G0, uno stato di riposo, e possono rientrare nel ciclo cellulare in fase G1 sotto appropriati stimoli mitogenici53. In questo studio, è stato osservato che il trattamento con rbST influenza fortemente la trascrizione CCND1., Prima della prima dose di rbST, non c’erano differenze significative tra i gruppi di controllo e rbST (Fig. 3). Tuttavia, dopo la prima dose, è stato possibile osservare differenze significative tra i due gruppi in diversi punti di campionamento. L’abbondanza relativa di CCND1 era significativamente più alta nel gruppo rbST che nel gruppo di controllo nei due primi cicli di trattamento con rbST (Fig. 2). Questo effetto sembra essere particolarmente evidente 9 giorni dopo la somministrazione di rbST, analogamente ai trascritti TNF e IL-1β., Pertanto, nei giorni 9, 23 e 35 dello studio, l’abbondanza relativa di CCND1 era significativamente più alta nel gruppo rbST rispetto al gruppo di controllo (Fig. 3). Infine, il giorno 84 (28 giorni dopo la 5a somministrazione di rbST), non ci sono state differenze significative tra i gruppi (Fig. 3) come nel caso delle citochine. Inoltre, l’ultimo giorno (219) di campionamento (51 giorni dopo le ultime dosi di rbST), non ci sono state differenze significative (P > 0,05) tra il gruppo rbST (0,433 ± 0,141) e il gruppo di controllo (0,430 ± 0,178)., Pertanto, la somministrazione esogena di rbST provoca una sovraespressione di CCND1. Ciò può comportare l’attivazione della cellula in fase G0 e, nel caso particolare del tessuto mammario, un aumento della produzione di latte aumentando il numero di cellule alveolari della ghiandola mammaria54.

Altri geni correlati al ciclo cellulare sono la proteina tumorale D52-like 2 (TPD52L2) e la sirtuina 2 (SIRT2). In modo simile a quello osservato per CCND1, TNF e IL-1β, è stato possibile trovare un’abbondanza relativa significativamente più alta (P < 0.001) di trascrizioni SIRT2 nel gruppo rbST (1.,517 ± 0,199) rispetto al gruppo di controllo (0,506 ± 0,250) il giorno 23 dello studio, ma in questo caso solo durante il secondo ciclo di somministrazione di rbST (Fig. 4). L’aumento dei livelli di trascritti CCND1 e SIRT2 dopo la seconda somministrazione di Lactotropina® nel gruppo trattato potrebbe essere il risultato di un effetto di rbST esogeno sul ciclo cellulare. La circolazione di questo ormone peptidico nell’organismo comporterebbe l’attivazione del ciclo cellulare nelle cellule bersaglio., Tuttavia, negli altri cicli rbST, la relazione tra la somministrazione della dose e i cambiamenti nell’abbondanza relativa dei trascritti SIRT2 non era così evidente come nella seconda dose. Oltre a quanto sopra, è notevole che il gruppo trattato abbia presentato un’abbondanza relativa significativamente più elevata di trascritti TPD52L2 (P < 0,05) durante i 4 giorni successivi alla prima somministrazione di rbST. Un altro componente implicato nel metabolismo cellulare dal suo ruolo rilevante nella traduzione è il fattore di allungamento eucariotico 1 gamma (EEF1G).,

In questo studio, l’abbondanza relativa di trascrizioni EEF1G non ha seguito una tendenza evidente correlata alla somministrazione di rbST., Tuttavia, nei giorni 17 e 30 (3 e 2 giorni dopo la seconda e la terza dose di rbST, rispettivamente), l’abbondanza relativa di trascritti EEF1G era significativamente più alta nel gruppo rbST. Uno studio precedente27 ha concluso che il trattamento con rbST aumenta i livelli di trascritti EEF1G nel tessuto mammario, ma ha utilizzato solo un punto di campionamento 6 giorni dopo la somministrazione di somatotropina. Pertanto, non è possibile confrontare direttamente tali risultati con i risultati ottenuti in questo studio, in cui sono stati utilizzati 36 punti campione per saggi trascrittomici nel corso di 8 mesi., Un altro gene incluso in questo studio è il globulo di grasso del latte-proteina del fattore 8 EGF (MFGE8). In Fig. 4, è possibile osservare che l’abbondanza relativa di MFGE8 nel gruppo rbST ha avuto una grande variabilità tra i giorni di campionamento. In particolare, McCoard et al.27 ha osservato che 6 giorni dopo la somministrazione di rbST, l’abbondanza relativa di MFGE8 nel tessuto mammario bovino era maggiore. Tuttavia, come accennato in precedenza, lo studio ha incluso un solo punto dati dopo una singola dose di rbST., L’attuale esperimento multidose a lungo termine ha dimostrato che i modelli di trascrizione nei bovini trattati con rbST presentano una grande variabilità nel tempo. Ad esempio, i dati ottenuti per CCND1 hanno mostrato che l’effetto di rbST sulla trascrizione di alcuni geni aumenta con il numero di dosi. Sebbene sia possibile che rbST influenzi la trascrizione del gene MFGE8, i risultati ottenuti hanno mostrato sia la regolazione su e giù., Pertanto, MFGE8 non può essere suggerito come candidato ideale per tracciare l’uso di rbST (ab) nei bovini, poiché non è stato possibile osservare una chiara tendenza nella sua trascrizione. Un altro gene correlato all’aderenza cellulare valutato in questo studio è la catenina alfa-simile 1 (CTNNAL1). Tuttavia, non è stato possibile trovare differenze significative nella sua trascrizione a seguito della somministrazione di rbST.

Altri geni

La lattoferrina (LTF) è una glicoproteina legante il ferro appartenente alla famiglia della transferrina55., La figura 4 mostra l’evoluzione delle abbondanze relative del gene LTF in tutti i punti di campionamento valutati in questo studio. Sebbene sia stata osservata una sovraregolazione dell’LTF in precedenti studi con sostanze anabolizzanti in cattle38, non è stato possibile stabilire una chiara tendenza all’LTF in relazione al trattamento con rbST. Ad esempio, nei giorni 9 e 53, l’abbondanza relativa di LTF è notevolmente inferiore negli animali trattati con rbST. Tuttavia, il giorno 91, l’abbondanza relativa era considerevolmente più alta in quel gruppo. È necessario discutere i risultati ottenuti per il gene del collagene di tipo III α 1 (COL3A1)., Uno studio precedente ha concluso che i trattamenti con rbST nei bovini da latte causano una sovraregolazione del gene COL3A1 nel tessuto mammario 6 giorni dopo la somministrazione di rbst27. Tuttavia, nel presente lavoro non è stato possibile rilevare le trascrizioni del gene COL3A1. Anche la trascrizione ESR2 non è stata rilevata in questo studio.

Un gruppo di geni per monitorare l’uso di rbST (ab)nei bovini da latte

Lo scopo finale di questo lavoro era quello di proporre un gruppo di geni di routine il cui schema di trascrizione combinato consentirebbe lo sviluppo di un metodo di screening per controllare l’uso improprio di rbST nelle aziende lattiero-casearie tramite MSC., A differenza di altri studi precedenti27,31, 32, questo lavoro ha analizzato i modelli di trascrizione dei geni correlati all’rbST in un esperimento di 8 mesi in condizioni reali che includeva 12 cicli di somministrazione e controllo degli animali rbST. Questo approccio ha permesso di ottenere dati più accurati al fine di distinguere tra mucche trattate con rbST e mucche di controllo.

L’analisi statistica multivariata è stata eseguita per chiarire le modifiche nei modelli di trascrizione MSCs come conseguenza della somministrazione di rbST., A tale scopo, è stata utilizzata solo la trascrizione dei nove geni che sono stati misurati con successo nell’intero esperimento (IGF1R, CCND1, TNF, IL1ß, SIRT2, EEFG1, MFEG8, LTF, TDP52L2), escludendo quei geni che si sono espressi solo in pochissimi casi/campioni. L’obiettivo principale dell’analisi PCA è identificare modelli globali nei dati, rilevando la correlazione tra diverse variabili, cioè in questo caso particolare, trascrizioni di diversi geni., La proiezione dei campioni nel nuovo spazio multidimensionale dei componenti principali (PC) consentirebbe potenzialmente una differenziazione tra rbST e gruppi di controllo, evidenziando anche quei geni con una maggiore capacità di biomarcatori del trattamento. Nella trama punteggio dell’analisi PCA mostrato in Fig. 5, una tendenza di raggruppamento potrebbe essere intravista nei due gruppi di campioni MSC, con animali trattati con rbST identificati come cerchi rossi e animali di controllo come scatole nere, ed etichettati in base al giorno sperimentale., Vari campioni del gruppo rbST sono apparsi mescolati con controlli sul lato sinistro della trama ma, curiosamente, la maggior parte di essi corrisponde a un giorno di somministrazione di somatotropina (giorni 14, 28, 57 o 84) o ai primi 2-3 giorni dopo una dose (giorni 2, 3, 17, 44 o 115), in cui non è stato rilevato un evidente disturbo trascrittomico. Al contrario, pochissimi animali di controllo potrebbero essere classificati come mucche trattate sul PCA, e la loro situazione è spiegata da valori estremi in particolare geni scarsamente discriminatori come LTF, MFGE8 o SIRT2.,

Anche i profili trascrittomici sono stati sottoposti a un OPLS-DA, dal quale sono stati evidenziati anche potenziali geni discriminatori. In Fig. 6a, viene mostrata la rappresentazione visiva del modello multivariato, con campioni MSC di animali di controllo tracciati come quadrati neri e campioni del gruppo rbST come cerchi rossi. In modo simile a PCA, diversi campioni rbST sono proiettati tra i campioni di controllo sul lato sinistro dell’ellisse., Tuttavia, questi campioni sono stati raccolti quando il disturbo trascrittomico causato da rbST era scomparso (o non era ancora apparso), così rigorosamente, potevano essere classificati come controlli in quel momento specifico. Al contrario, pochissimi campioni di controllo sono stati classificati erroneamente come rbST. Quando nessun set di test è disponibile come in questo caso, il metodo di convalida incrociata è la strategia principale per valutare la qualità di un modello. I risultati della procedura di validazione incrociata sono riassunti dal valore di diversi parametri di qualità., In questo studio, il modello multivariato OPLS ha mostrato le seguenti caratteristiche: R2(X) = 0,6, R2 (Y) = 0,4 e Q2 = 0,3. Il modello spiega il 60% della variazione nello spazio x e il 40% della variazione nello spazio y e la bontà della previsione è del 30%. Questi valori indicano una descrizione relativamente buona dei dati da parte del modello e la predittibilità media34. Il valore p calcolato dal CV-ANOVA era 3,01 × 10-7, suggerendo l’esistenza di differenze significative tra le due classi del modello., Il fatto che questo modello sia stato costruito con un pannello di geni con diverse capacità discriminanti non dovrebbe essere ignorato, in quanto influisce sul potere discriminante degli OPL. Inoltre, quei giorni sperimentali con pochissimo o nessun effetto rbST sulle loro trascrizioni stanno sicuramente polarizzando il modello poiché nella pratica appartengono a un gruppo ma agiscono come l’altro., Nei futuri modelli di screening multivariati, deve essere utilizzato un pannello di geni altamente discriminatori selezionati e, preferibilmente, campioni “noti” e “sconosciuti” da proiettare nel modello multivariato apparterranno a popolazioni simili (età, razza, ecc.) e momenti di allattamento, nel tentativo di superare la variabilità interindividuale degli animali35. In questo tipo di approcci, è anche importante che la popolazione predittiva sia più grande dei campioni previsti. Infine, le ragioni della discriminazione sull’OPLS-DA sono state esaminate nel corrispondente S-plot (Fig., 6b), che ha rivelato il contributo di ciascuna variabile (trascrizione genica) alla separazione delle due classi campione. Come commentato nelle sezioni precedenti, la trascrizione più discriminante in MSC è stata trovata nei geni CCND1, IGF-1R, TNF e IL-1β. Sembra chiaro che i trattamenti rbST innescano una sovraregolazione di questi geni e il loro uso nei futuri pannelli di monitoraggio è un’opzione promettente per il controllo di routine nel settore lattiero-caseario.,

Come in un controllo di routine per rilevare l’uso illecito di rbST con questo pannello genico, non ci sarebbero informazioni su quando le mucche sono state trattate (in altre parole, è un test cieco), idealmente ogni giorno durante l’allattamento dovrebbe essere campionata / controllata. Tuttavia, da un punto di vista pratico, questo suggerimento sembra un po ‘ irrealistico. Ciò che viene proposto è una raccolta casuale di latte una volta alla settimana, alternando giorni feriali., Poiché la somatotropina viene somministrata regolarmente durante l’allattamento (a partire da 80-100 giorni dopo il parto, bisettimanale), in tutte le mucche in allattamento della fattoria, con un buon piano di campionamento, ad un certo punto rbST dovrebbe essere rilevato nella fattoria. I dati trascrittomici ottenuti dai campioni raccolti devono essere confrontati con un set di dati trascrittomici di una popolazione di controllo. Quei campioni che presentavano valori più elevati di geni proposti in questo documento dovrebbero essere considerati sospetti. Il secondo passo dovrebbe essere indagare la situazione particolare di ogni mucca “positiva” (mastite, gravidanza, ecc.,) e, se necessario, continuare l’analisi di conferma. È importante evidenziare anche le elevate capacità di produzione di questo approccio di PCR in tempo reale, rendendo fattibile il piano di campionamento.