DIAGNOSI DI LABORATORIO DI EMOGLOBINOPATIE
L’indagine primaria di un’emoglobinopatia dovrebbe includere un esame emocromocitometrico completo, un film di sangue periferico e un’elettroforesi dell’emoglobina (vedi Fig. 29.4). La conta ematica completa consente di valutare la formazione di emoglobina, come giudicato dagli indici eritrocitari, dal volume medio delle cellule (MCV) e dall’emoglobina media delle cellule (MCH)., Microcitosi (MCV < 76 fl) e ipocromia (MCH < 27 pg), a fronte di un numero di globuli rossi normale o aumentato (> 5,5 × 1012/L) in un paziente pieno di ferro, suggeriscono una diagnosi di talassemia. Nel caso della β talassemia maggiore o intermedia, ciò è associato ad un grado significativo di anemia, mentre nel tratto della talassemia l ‘ emoglobina è generalmente normale o solo marginalmente ridotta. L’esame di un film di sangue macchiato con un metodo Giemsa può essere utile per confermare la diagnosi., Tuttavia, la diagnosi definitiva si basa spesso sull’analisi elettroforetica o cromatografica dell’emoglobina negli emolisati degli eritrociti. L’elettroforesi dell’acetato di cellulosa a pH alcalino (8,9–9,1) è il metodo più ampiamente usato, essendo semplice, rapido, economico ed efficace nella separazione delle varianti comuni dell’emoglobina. Nell ‘anemia falciforme omozigote predomina l’ HbS. È presente una quantità variabile di HbF, proporzioni più elevate (> 10%) generalmente associate a un decorso clinico più lieve. La concentrazione di emoglobina A2 è generalmente normale.,
Il test di solubilità basato sulla ridotta solubilità del deossi-HbS in presenza di agenti riducenti, ad esempio il ditionito di sodio, ha un ruolo limitato nella diagnosi di anemia falciforme poiché non differenzia la malattia omozigote e gli stati portatori. In una situazione di emergenza, un test di solubilità positivo eseguito in combinazione con un’emoglobina significativamente ridotta e la tipica morfologia degli eritrociti indica fortemente una diagnosi di anemia falciforme. Ciò deve essere confermato non appena possibile dall ‘analisi dell’ emoglobina., Diverse altre varianti, tra cui HbD, HBG e Hb Lepore, hanno una mobilità elettroforetica identica a quella di HbS sull’acetato di cellulosa, ma possono essere distinte dal test di solubilità della falce negativa e dall’elettroforesi su gel di citrato agar a pH acido (6.0). Allo stesso modo, le emoglobine C, E e O, che co-migrano su acetato di cellulosa a pH alcalino, possono essere differenziate mediante elettroforesi di agar citrato. Sia Hbe che Hb Lepore sono associati a indici talassemici di globuli rossi, il che aiuta ulteriormente la loro distinzione da varianti elettroforeticamente simili., La messa a fuoco isoelettrica migliora la risoluzione di alcune varianti strutturali e può essere utilizzata anche per lo screening neonatale di eluati da carte Guthrie (dried blood spot), poiché riduce l’interferenza della metaemoglobina presente in tali campioni.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un metodo veloce e sensibile per la separazione e la quantificazione delle emoglobine che, in alcuni casi, consente l’identificazione di varianti non possibili con altre tecniche., Poiché è in gran parte automatizzato e richiede piccole quantità di campione, l’HPLC è diventato il metodo di scelta per test di popolazione su larga scala come i programmi di screening neonatale. Lo screening neonatale universale per la malattia falciforme è stato utilizzato negli Stati Uniti e in Inghilterra per qualche tempo, e programmi simili sono stati introdotti in altri paesi europei, mediorientali e africani, a seconda della prevalenza delle condizioni e delle risorse disponibili., Tali programmi hanno portato notevoli benefici in termini di riduzione della mortalità e della morbilità grazie a una migliore assistenza, all’attuazione precoce della profilassi contro l’infezione da pneumococco e all’educazione dei genitori. Nella β talassemia, la proporzione di singole emoglobine varia a seconda del genotipo sottostante. La β0 talassemia omozigote è associata a una predominanza di HbF, assenza di HbA e quantità variabili di HbA2 (intervallo 1,0–6,0%, media 1,7%). Negli individui con β+ talassemia omozigote o β0/β+ talassemia eterozigote composta, è presente una quantità variabile di HbA., L ‘ emoglobina F è aumentata e distribuita in modo eterogeneo tra gli eritrociti.
La quantificazione accurata di HbA2 mediante HPLC o cromatografia a microcolonna è essenziale per la diagnosi del tratto β talassemico, in cui l’HbA2 è elevato, tipicamente> 3,5%., I portatori di talassemia β “normale A2” o “silente” dovuta a lievi difetti del gene β o alla co-ereditarietà di una mutazione del gene δ in cis o trans non possono essere facilmente distinti dalla talassemia α con metodi di screening convenzionali e richiedono indagini con tecniche specializzate, tra cui la sintesi in vitro della catena globinica e l’analisi del DNA. L’analisi dei rapporti sintetici della catena della globina mediante incorporazione di leucina tritiata e cromatografia carbossimetilcellulosa è il modo definitivo di identificare gli individui con talassemia, anche se è usato raramente a causa della sua natura laboriosa.,
Le α talassemie sono caratterizzate elettroforeticamente dalla presenza delle varianti in rapido movimento, Hb Bart (γ4) e HbH (β4), che sono più evidenti nei campioni neonatali. In hydrops fetalis a causa di omozigote α0 talassemia, Hb Bart predomina e si trova in piccole quantità in altre sindromi α talassemia nel periodo neonatale. L’emoglobina H può anche essere rilevata mediante colorazione per i corpi di inclusione di HbH., La diagnosi di forme clinicamente silenti di α talassemia è spesso di esclusione, essendo fatta sulla base dell’origine etnica del soggetto, degli indici microcitici ipocromici dei globuli rossi e di una concentrazione di HbA2 normale o bassa in presenza di uno stato di ferro normale. La diagnosi definitiva può essere fatta mediante analisi del DNA, che può anche distinguere spesso α0 e α + talassemia.,
Mentre la maggior parte delle emoglobinopatie può essere diagnosticata mediante elettroforesi emoglobinica, varianti causate da sostituzioni di aminoacidi che non alterano la carica, come quelle riscontrate in alcune emoglobine instabili o emoglobine con alterata affinità di ossigeno, possono sfuggire al rilevamento. Ulteriori indagini che possono essere utili in questo contesto includono la valutazione dell ‘instabilità dell’ emoglobina e dell ‘affinità con l’ ossigeno., L’analisi del DNA ad alto rendimento ha reso questo un modo fattibile di screening per le mutazioni della globina nei paesi più ricchi, con tecniche come l’amplificazione della sonda multiplex legatura-dipendente che consente l’identificazione di grandi mutazioni geniche che in precedenza erano rilevabili solo utilizzando Southern blotting. La spettrometria di massa dell’emoglobina può anche essere utilizzata per identificare globine anomale misurandone accuratamente la massa, con particolare potenziale impiego in programmi di screening che già utilizzano la spettrometria di massa.,
L’identificazione delle coppie a rischio di emoglobinopatie maggiori mediante screening prenatale o preconcezionale consente una scelta riproduttiva informata con l’opzione della diagnosi prenatale. Nella maggior parte dei casi, questo può ora essere realizzato nel primo trimestre rilevando geni globinici mutanti nel DNA villoso corionico. In diversi paesi, in particolare a Cipro, dove il tasso di portanza della β talassemia raggiunge il 12%, ciò ha portato a una marcata diminuzione dell’incidenza alla nascita dei disturbi dell’emoglobina., La diagnosi genetica preimpianto è sempre più utilizzata per consentire la selezione di embrioni non affetti, anche se continua ad essere un processo impegnativo e costoso che non è applicabile alla maggior parte delle coppie. I tentativi continuano a sviluppare diagnosi prenatale non invasiva utilizzando cellule fetali e DNA nel sangue materno, anche se questo non è attualmente tecnicamente fattibile come procedura di routine per le emoglobinopatie.
