DISCUSSIONE
La colorazione Gram è la procedura di colorazione più utilizzata in batteriologia. Si chiama una macchia differenziale poiché differenzia tra batteri Gram-positivi e Gram-negativi. Batteri che macchia viola con la procedura di colorazione Gram sono definiti Gram-positivi; quelli che macchia rosa sono detto di essere Gram-negativi. I termini positivo e negativo non hanno nulla a che fare con la carica elettrica, ma semplicemente designano due distinti gruppi morfologici di batteri.,
I batteri gram-positivi e Gram-negativi si colorano in modo diverso a causa delle differenze fondamentali nella struttura delle loro pareti cellulari. La parete cellulare batterica serve a dare all’organismo le sue dimensioni e la sua forma, nonché a prevenire la lisi osmotica. Il materiale nella parete cellulare batterica che conferisce rigidità è peptidoglicano.
Nei micrografi elettronici, la parete cellulare Gram-positiva appare come una parete ampia e densa di 20-80 nm di spessore e costituita da numerosi strati interconnessi di peptidoglicano (Figure 1A e 1B). Chimicamente, dal 60 al 90% della parete cellulare Gram-positiva è peptidoglicano., Intrecciati nella parete cellulare dei Gram-positivi sono gli acidi teichoici. Gli acidi teichoici, che si estendono attraverso e oltre il resto della parete cellulare, sono composti da polimeri di glicerolo, fosfati e ribitolo di alcool zuccherino. Alcuni hanno un legame lipidico (acido lipoteichoico). La superficie esterna del peptidoglicano è costellata di proteine che differiscono dal ceppo e dalla specie del batterio.,
La parete cellulare Gram-negativa, invece, contiene solo 2-3 strati di peptidoglicano ed è circondata da una membrana esterna composta da fosfolipidi, lipopolisaccaridi, lipoproteine e proteine (Figure 2A e 2B). Solo il 10% – 20% della parete cellulare Gram-negativa è peptidoglicano. I fosfolipidi si trovano principalmente nello strato interno della membrana esterna, così come le lipoproteine che collegano la membrana esterna al peptidoglicano., I lipopolisaccaridi, situati nello strato esterno della membrana esterna, sono costituiti da una porzione lipidica chiamata lipide A incorporata nella membrana e da una porzione polisaccaridica che si estende verso l’esterno dalla superficie batterica. La membrana esterna contiene anche un numero di proteine che differiscono con il ceppo e la specie del batterio.,
Per maggiori informazioni su Gram-negativi e Gram-positivi parete cellulare, vedere i seguenti Oggetti di Apprendimento nella tua presentazione Guida:
- La Parete delle Cellule Procariote; Unità 1, Sezione IIB2
- I batteri Gram-Positivi Parete Cellulare; Unità 1, Sezione IIB2a
- Gram-Negativo della Parete Cellulare; Unità 1, Sezione IIB2b
La colorazione di Gram procedura prevede quattro passaggi di base:
1. I batteri vengono prima macchiati con il colorante base crystal violet. Entrambi i batteri Gram-positivi e Gram-negativi diventano direttamente macchiati e appaiono viola dopo questo passaggio.,
2. I batteri vengono quindi trattati con la soluzione di iodio di Gram. Ciò consente di trattenere meglio la macchia formando un complesso di iodio viola-cristallo insolubile. Entrambi i batteri Gram-positivi e Gram-negativi rimangono viola dopo questo passaggio.
3. Viene quindi aggiunto il decolorante di Gram, una miscela di alcol etilico e acetone. Questo è il passo differenziale. I batteri gram-positivi mantengono il complesso di cristallo viola-iodio mentre i Gram-negativi vengono decolorati.
4. Infine, viene applicato il controdolore safranin (anche un colorante di base)., Poiché i batteri Gram-positivi sono già macchiati di viola, non sono influenzati dal contrattacco. I batteri gram-negativi, che ora sono incolori, diventano direttamente macchiati dalla safranina. Quindi, i Gram-positivi appaiono viola e i Gram-negativi appaiono rosa.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, autori, Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.,
Con l’attuale teoria alla base della colorazione di Gram, si pensa che nei batteri Gram-positivi, il viola cristallino e lo iodio si combinano per formare una molecola più grande che precipita all’interno della cellula. La miscela alcol / acetone provoca quindi la disidratazione del peptidoglicano multistrato, diminuendo così lo spazio tra le molecole e causando la parete cellulare a intrappolare il complesso di cristallo viola-iodio all’interno della cellula., Nel caso di batteri Gram-negativi, la miscela alcol/acetone, essendo un solvente lipidico, dissolve la membrana esterna della parete cellulare e può anche danneggiare la membrana citoplasmatica a cui è attaccato il peptidoglicano. I pochi strati di peptidoglicano non sono in grado di trattenere il complesso di cristallo viola-iodio e la cellula viene decolorata.
È importante notare che la Gram-positività (la capacità di mantenere il complesso viola-iodio di cristallo viola) non è un fenomeno tutto o niente, ma una questione di grado., Ci sono diversi fattori che potrebbero causare un organismo Gram-positivo colorazione Gram-negativamente:
1. Il metodo e le tecniche utilizzate. Il surriscaldamento durante la fissazione del calore, la decolorazione eccessiva con alcool e persino un lavaggio eccessivo con acqua tra i passaggi possono causare la perdita di batteri Gram-positivi del complesso di cristallo viola-iodio.
2. L’età della cultura. Le colture più vecchie di 24 ore possono perdere la loro capacità di trattenere il complesso di cristallo viola-iodio.
3. L’organismo stesso., Alcuni batteri Gram-positivi sono più in grado di trattenere il complesso di cristallo viola-iodio rispetto ad altri.
Pertanto, è necessario utilizzare tecniche molto precise nella colorazione di Gram e interpretare i risultati con discrezione.
Tripticasi Soy agar plate culture di Escherichia coli (un piccolo bacillo gram-negativo) e Staphylococcus epidermidis (un coccus Gram-positivo con una disposizione di staphylococcus).
PROCEDURA (da eseguire individualmente)
1., Escherichia coli
a. Heat-fissare uno striscio di Escherichia coli come segue:
1. Utilizzando il flacone contagocce di acqua deionizzata trovato nel rack di colorazione, posizionare 1/2 di una goccia d’acqua di dimensioni normali su un vetrino pulito toccando il contagocce sul vetrino (Figura 1). Altenately, usi il vostro ciclo sterilizzato di inoculazione per disporre una goccia di acqua deionizzata sulla diapositiva.
2., Utilizzando il ciclo di inoculazione sterile, rimuovere asetticamente una piccola quantità di coltura dalla superficie dell’agar e toccarla delicatamente 2 – 3 volte fino alla goccia d’acqua fino a quando l’acqua diventa visibilmente torbida (Figura 2). Una buona macchia con la giusta quantità di batteri è essenziale per la colorazione di Gram.
- Troppi batteri sul vetrino potrebbero causare una decolorazione insufficiente; troppo pochi potrebbero portare a una decolorazione eccessiva.
3. Incenerire i batteri rimanenti sul ciclo di inoculazione., Se viene aggiunta troppa cultura all’acqua, non vedrai singoli batteri macchiati e potresti non avere una macchia di gram affidabile.
4. Dopo che il ciclo di inoculazione si è raffreddato, distribuire la sospensione su circa metà del vetrino per formare un film sottile. Uno striscio correttamente preparato con la giusta quantità di batteri dovrebbe apparire simile a Fig. 3.
5. Lasciare asciugare completamente questa sospensione sottile all’aria (Figura 4). Lo striscio deve essere completamente asciutto prima che la diapositiva sia fissata al calore!
6., Per riscaldare-fissare i batteri al vetrino, prendere il vetrino essiccato all’aria con una pinza coprioggetti e tenere il fondo del vetrino di fronte allo striscio vicino all’apertura del microinceneratore per 10 secondi (Figura 5) come dimostrato dal vostro istruttore. Se la diapositiva non è abbastanza riscaldata, tutti i batteri si laveranno via. Se è surriscaldato, l’integrità strutturale dei batteri può essere danneggiata.
b. Macchia con il viola di cristallo di Hucker per un minuto (Figura 6). Lavare delicatamente con acqua (Figura 7). Scrollarsi di dosso l’acqua in eccesso ma non asciugare tra i passaggi.
c., Macchia con soluzione di iodio di Gram per un minuto (Figura 8) e lavare delicatamente con acqua.
d. Decolorare raccogliendo la diapositiva e lasciando che il decolorizzatore del grammo scenda lungo la diapositiva fino a quando il viola smette di scorrere nella parte inferiore della diapositiva (Figura 9).
- Assicurati che l’intero striscio sia uniformemente decolorato e che non sia sotto-decolorato o sopra-decolorato.
- Lavare immediatamente con acqua.
e. Macchiare con safranina per un minuto (Figura 10)., Quando si lava la safranina in eccesso, fare molta attenzione a lavare delicatamente e brevemente in quanto è possibile lavare parte della sarfanina nel batterio.
f. Asciugare (Figura 11) e osservare con la microscopia ad immersione in olio.
2. Staphylococcus epidermidis
a. Riscaldare-fissare uno striscio di Staphylococcus epidermidis come segue:
1. Utilizzando il flacone contagocce di acqua deionizzata trovato nel rack di colorazione, posizionare 1/2 di una goccia d’acqua di dimensioni normali su un vetrino pulito toccando il contagocce sul vetrino (Figura 1)., Altenately, usi il vostro ciclo sterilizzato di inoculazione per disporre una goccia di acqua deionizzata sulla diapositiva.
2. Utilizzando il ciclo di inoculazione sterile, rimuovere asetticamente una piccola quantità di coltura dalla superficie dell’agar e toccarla delicatamente 2 – 3 volte fino alla goccia d’acqua fino a quando l’acqua diventa visibilmente torbida (Figura 2).
- Troppi batteri sul vetrino potrebbero causare una decolorazione insufficiente; troppo pochi potrebbero portare a una decolorazione eccessiva.
3. Incenerire i batteri rimanenti sul ciclo di inoculazione., Se viene aggiunta troppa cultura all’acqua, non vedrai singoli batteri macchiati e potresti non avere una macchia di gram affidabile.
4. Dopo che il ciclo di inoculazione si è raffreddato, distribuire la sospensione su circa metà del vetrino per formare un film sottile (Figura 3).
5. Lasciare asciugare completamente questa sospensione sottile all’aria (Figura 4). Lo striscio deve essere completamente asciutto prima che la diapositiva sia fissata al calore!
6., Per riscaldare-fissare i batteri al vetrino, prendere il vetrino essiccato all’aria con una pinza coprioggetti e tenere il fondo del vetrino di fronte allo striscio vicino all’apertura del microinceneratore per 10 secondi (Figura 5) come dimostrato dal vostro istruttore. Se la diapositiva non è abbastanza riscaldata, tutti i batteri si laveranno via. Se è surriscaldato, l’integrità strutturale dei batteri può essere danneggiata.
b. Macchia con il viola di cristallo di Hucker per un minuto (Figura 6). Lavare delicatamente con acqua (Figura 7). Scrollarsi di dosso l’acqua in eccesso ma non asciugare tra i passaggi.
c., Macchia con soluzione di iodio di Gram per un minuto (Figura 8) e lavare delicatamente con acqua.
d. Decolorare raccogliendo la diapositiva e lasciando che il decolorizzatore del grammo scenda lungo la diapositiva fino a quando il viola smette di scorrere nella parte inferiore della diapositiva (Figura 9).
- Assicurati che l’intero striscio sia uniformemente decolorato e che non sia sotto-decolorato o sopra-decolorato.
- Lavare immediatamente con acqua.
e. Macchiare con safranina per un minuto (Figura 10)., Quando si lava la safranina in eccesso, fare molta attenzione a lavare delicatamente e brevemente in quanto è possibile lavare parte della sarfanina nel batterio.
f. Asciugare e osservare con la microscopia ad immersione in olio.
3. Assicurati di versare con attenzione il colorante usato nel vassoio di colorazione nel contenitore di raccolta della tintura dei rifiuti, non nel lavandino.
© Hussein Shoeb, autore. Concesso in licenza per l’uso, ASM MicrobeLibrary.
B., LA MACCHIA DELLA CAPSULA
DISCUSSIONE
Molti batteri secernono una copertura viscida e viscosa chiamata capsula o glicocalice . Questo di solito è composto da polisaccaride, polipeptide o entrambi.
La capacità di produrre una capsula è una proprietà ereditaria dell’organismo, ma la capsula non è un componente cellulare assolutamente essenziale. Le capsule sono spesso prodotte solo in condizioni di crescita specifiche. Anche se non sono essenziali per la vita, le capsule aiutano robably i batteri a sopravvivere in natura., Le capsule aiutano molti batteri patogeni e normali della flora a resistere inizialmente alla fagocitosi dalle cellule fagocitiche dell’ospite. Nel suolo e nell’acqua, le capsule aiutano a prevenire che i batteri vengano inghiottiti dai protozoi. Le capsule aiutano anche molti batteri ad aderire alle superfici e quindi a resistere al rossore. Consente inoltre a molti batteri di formare biofilm. Un biofilm è costituito da strati di popolazioni batteriche aderenti alle cellule ospiti e incorporati in una massa capsulare comune.,
Per maggiori informazioni su batterica capsule, vedere i seguenti Oggetti di Apprendimento nella tua presentazione Guida:
- Il Glicocalice (Capsula) e S-Layer; Unità 1, Sezione IIB4a
- La Capacità di Resistere Fagocitaria Engulfment; Unità 3, Sezione B5b
ORGANISMO
il Latte Scremato in brodo di cultura di Enterobacter aerogenes. Il latte scremato fornisce nutrienti essenziali per la produzione di capsule e fornisce anche uno sfondo leggermente macchiabile.
PROCEDURA (da eseguire singolarmente)
1., Mescolare la coltura del brodo di latte scremato con il ciclo e posizionare 2-3 cicli di Enterobacter aerogenes su un vetrino da microscopio.
2. Utilizzando il ciclo di inoculazione, distribuire il campione per coprire circa un pollice della diapositiva.
3. Lasciare asciugare completamente all’aria. Non riscaldare fix. Le capsule si attaccano bene al vetro e il calore può distruggere la capsula.
4. Stain con cristallo viola per un minuto.
5. Lavare la tintura in eccesso con una soluzione di solfato di rame al 20%.
6. Scrollarsi di dosso la soluzione di solfato di rame in eccesso e asciugare immediatamente.
7. Osservare utilizzando la microscopia ad immersione in olio., L’organismo e il latte essiccato sul vetrino raccoglieranno la tintura viola mentre la capsula rimarrà incolore.
8. Assicurati di versare con attenzione il colorante usato nel vassoio di colorazione nel contenitore di raccolta della tintura dei rifiuti, non nel lavandino.
9. Osservare la colorazione della capsula dimostrativa di Streptococcus lactis, un batterio incapsulato che è normale flora nel latte.
A. La macchia di Gram
Crea disegni di ogni batterio sulla tua preparazione di macchie di Gram.,
|
|
|
| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., La macchia della capsula
Faccia un disegno della sua preparazione della macchia della capsula di Enterobacter aerogenes e della macchia della capsula di dimostrazione di Streptococcus pneumoniae.
Macchia della capsula di
Streptococcus lactis
