Ci vuole un vero sforzo per mantenere le vostre conoscenze di base di biologia molecolare e cellulare fresco, oltre a tutto il resto che dovete fare. Non sarebbe bello se ci fosse un posto dove si potrebbe trovare articoli di facile lettura che consentono di brush-up su quelle basi in appena un paio di minuti?
hope Spero che tu abbia detto “sì”, perché questo è lo scopo della mia serie di articoli” The Basics:”, che abbiamo già e continueremo a portarti periodicamente. Questo articolo spiega le basi della legatura del DNA.,
Il tuo compagno di legatura del DNA: la DNA Ligasi
La DNA ligasi (EC 6.5.1.1) è l’enzima al centro della reazione di legatura del DNA. Unisce covalentemente la spina dorsale del fosfato del DNA con estremità coesive smussate o compatibili (vedi Figura 1) e il suo ruolo naturale è nella riparazione delle rotture a doppio filamento nelle molecole di DNA. In biologia molecolare è comunemente usato per l’inserimento di frammenti di DNA generati da enzimi di restrizione in dorsali vettoriali. Le ligasi commerciali sono fornite con un tampone di reazione contenente ATP e Mg2+, che sono entrambi essenziali per l’attività della ligasi., Poiché l’ATP può essere danneggiato da ripetuti cicli di congelamento-disgelo, è consigliabile effettuare aliquote del buffer (vedere il mio articolo “5 punte di legatura del DNA”).
Figura 1. Estremità coesive e smussate, pronte per la legatura del DNA!
I due passaggi della reazione di legatura del DNA
La reazione di legatura del DNA stessa ha due passaggi fondamentali. In primo luogo le estremità del DNA devono scontrarsi per caso e stare insieme abbastanza a lungo per la ligasi di unirsi a loro. Questa è la parte più inefficiente della reazione, ma è più facile a basse temperature. Perché?, Bene, come probabilmente saprai, tutte le molecole si muovono più velocemente a temperature più elevate, quindi puoi immaginare che sarà più facile per due estremità del DNA scontrarsi e stare insieme se galleggiano delicatamente attraverso la soluzione a bassa temperatura, piuttosto che sfrecciare come sarebbero a temperature più elevate. Per le estremità coesive, c’è un motivo in più; temperature più basse stabilizzano il legame di idrogeno tra i nucleotidi complementari, che aiuta davvero a mantenere le cose a posto.
Figura 2., Reazione enzimatica della legatura del DNA
Il secondo passo è la reazione enzimatica, che viene mostrata schematicamente nella Figura 2.. La DNA ligasi catalizza l’unione del 3 ‘- OH al 5 ‘ – fosfato tramite un meccanismo in due fasi. In primo luogo, il nucleotide di AMP, che è attaccato ad un residuo della lisina nel sito attivo dell’enzima, è trasferito al 5’-fosfato. Quindi il legame AMP-fosfato viene attaccato dal 3 ‘ – OH, formando il legame covalente e rilasciando AMP. Per consentire all’enzima di effettuare ulteriori reazioni, l’AMP nel sito attivo dell’enzima deve essere reintegrato dall’ATP.,
Ecco perché effettuare la legatura del DNA a basse temperature può aiutare
L’enzima DNA ligasi ha un’attività ottimale a 25°C quindi la reazione di legatura viene effettuata ad una temperatura che è un compromesso tra le temperature ottimali per portare insieme le estremità del DNA (1°C) e la reazione enzimatica (25°C). Normalmente 1 ora a 16°C va bene, ma poiché portare le estremità del DNA insieme è la parte meno efficiente della reazione favorendo questo abbassando la temperatura a 4°C può dare ancora più efficienza. Tuttavia, l’enzima funzionerà molto lentamente a questa temperatura in modo lungo (ad es., durante la notte) è richiesto il tempo di incubazione.
Originariamente pubblicato il 31 ottobre 2007; aggiornato e ripubblicato il 5 dicembre 2014.
Questo ti ha aiutato? Quindi si prega di condividere con la rete.
