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Campioni non trattati. In particolare, osserviamo che, anche in campioni non colorati, le differenze tra gocce d’acqua e olio (Fig. 1 B e C) o tra diversi costituenti della cellula (Fig. 1D) generare un contrasto sufficiente per distinguerli. Nelle cellule, materiali più alti come sali, fosforo e ferro, che possono essere concentrati in diverse regioni, tendono a migliorare il contrasto. Fico., 1D mostra una cellula ovarica di criceto cinese non trattata (CHO) in mezzo di coltura normale a temperatura ambiente. Il contorno cellulare e il nucleo con la sua struttura interna sono chiaramente visibili, così come una serie di particelle scure e sferiche nel citoplasma. L’identificazione di queste particelle come goccioline lipidiche è discussa di seguito.

Colorazione di metalli pesanti. I limiti di risoluzione e contrasto quando si osservano materiali a bassa Z suggeriscono che si possono ottenere vantaggi sostanziali colorando le cellule con marcatori ad alta Z come macchie elettrone-dense o etichette d’oro nanoparticelle., Infatti, siamo in grado di rilevare perle d’oro in acqua fino ad un diametro di 10 nm utilizzando membrane ultrasottili (dati non mostrati).

La colorazione differenziale degli organelli all’interno delle cellule utilizzando materiali electrondense è uno standard nella tecnica EM, anche se di solito non viene applicata per SEM. Fico. 2 mostra una ricca varietà di strutture all’interno di cellule coltivate che sono state coltivate direttamente sulla membrana divisoria e poi fissate e colorate con acetato di uranile (8). Gli organelli intracellulari sono chiaramente visibili, compresi i dettagli interni dei mitocondri (Fig. 2C), fibre di stress di actina (Fig., 2D), e strutture tubolari e citoscheletriche complesse (Fig. 2 Lettere A e B). L’energia del fascio superiore in Fig. 2C sonda la struttura interna, mentre a energia più bassa (Fig. 2D ), viene visualizzata la superficie vicina alla membrana. Pertanto, diverse energie possono essere utilizzate per ottenere informazioni tridimensionali.

Marcatori di nanoparticelle d’oro. L’alta risoluzione e la specificità del rilevamento possono essere ottenute legando anticorpi o altri ligandi., Come con altri metodi EM, etichettatura è fatto più convenientemente utilizzando nanoparticelle d’oro. In contrasto con transmission EM (TEM), che campiona solo sezioni molto sottili e spesso arbitrarie, wet SEM consente una rapida commutazione tra la visione locale e globale dell’etichettatura in tutta la cella. Fico. 3 A e B mostrano come gli anticorpi monoclonali antiepidermici monoclonali del recettore del fattore di crescita di nanoparticelle di 40 nm sono stati utilizzati per etichettare i recettori del fattore di crescita epidermico sulle cellule tumorali A431 intatte., La fissazione è spesso utile e conveniente anche in SEM bagnato e può facilitare l’etichettatura e il trasferimento al microscopio. Le cellule qui presentate sono anche colorate con acetato di uranile, che consente l’allineamento dei recettori marcati con la struttura generale delle cellule. L’elevato contrasto e la dimensione uniforme delle nanoparticelle consentono un’identificazione e una localizzazione univoche. Conoscere la localizzazione precisa delle singole molecole del recettore apre la possibilità di misurare eventi come la dimerizzazione del recettore indotta dal fattore di crescita epidermico., La colorazione delle cellule non è necessaria per l’etichettatura e abbiamo incluso un’immagine di cellule etichettate non colorate (Fig. 7, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS). Viene anche mostrata un’immagine che dimostra che è possibile contrassegnare le parti interne della cella (Fig. 8, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS), in questo caso, la marcatura dei mitocondri con perline d’oro. L’etichettatura dei filamenti di actina all’interno delle cellule è stata ottenuta anche utilizzando particelle d’oro subnanometriche, seguite dal miglioramento dell’argento (dati non mostrati).

Un esempio di etichettatura oro sui batteri è dato in Fig. 3 QUATER . Qui, il recettore della gastrina putativo di Helicobacter pylori (9) viene rilevato mediante incubazione con complessi di gastrina biotinilata e nanoparticelle d’oro a 20 nm rivestite con streptavidina. La somministrazione della gastrina biotinilata prima di quella dell’oro rivestito di streptavidina non ha prodotto quasi nessun attaccamento di nanoparticelle al batterio. Questo risultato è stato ottenuto indipendentemente dal tempo tra i due passaggi, suggerendo che l’assorbimento di gastrina in H. pylori è quasi immediato., Il fatto che la gastrina complessata non sia entrata nelle cellule indica la possibilità di definire i limiti della dimensione delle particelle che possono essere interiorizzate dai batteri.

Confronto delle tecniche di imaging (Trypanosoma brucei). È utile confrontare questa tecnologia con le tecniche di imaging esistenti utilizzando un sistema a modello singolo. Tale studio è dettagliato in Fig. 4, utilizzando la forma prociclica parassita T. brucei che si propaga nel midgut della mosca tsetse. Le prime tre immagini mostrano le modalità di imaging esistenti: microscopia ottica a fluorescenza (Fig., 4A), microscopia differenziale di contrasto di interferenza (Fig. 4B), e TEM (Fig. 4 QUATER). La forza delle tecniche esistenti è evidente: marcatura localizzata in fluorescenza e sezioni dettagliate in TEM. L’ottica non trattata (Fig. 4B) e wet-SEM (Fig. 4D) le immagini delineano i bordi della cella ma sono a basso contrasto e mancano di dettagli. Entrambi sottolineano il nucleo, ma altri organelli che appaiono nell’immagine di contrasto di interferenza differenziale non sono chiaramente identificati, mentre l’immagine wet-SEM porta le goccioline lipidiche a un vantaggio. Colorazione del tetrossido di osmio (Fig., 4E) non è così utile in questo sistema, sottolineando principalmente le goccioline lipidiche e alcuni organelli interni non identificati. L’imaging più forte è visto in Fig. 4F, per il quale è stata utilizzata la colorazione dell’acetato di uranile. Il vantaggio della rappresentazione intatta con cui la cellula completa può essere veduta (con le sue strutture interne fini che possono essere osservate in dettaglio) è evidente, particolarmente in confronto alla rappresentazione di TEM (Fig. 4 QUATER). Infine, l’imaging wet-SEM della marcatura specifica per tutta la cellula con anticorpi contro la principale proteina di rivestimento superficiale ancorata al glicosilfosfatidilinositolo EP prociclina (10) è mostrato in Fig., 4 G e H . È interessante notare che la prociclina EP è nota per coprire l’intera cellula in modo uniforme, ma il segnale osservato è raggruppato. Attribuiamo questo alla tendenza delle zattere lipidiche sottostanti a raggrupparsi sotto l’influenza degli anticorpi, un processo che la fissazione in formaldeide non è in grado di prevenire. I marcatori d’oro chiariscono anche la conformazione tridimensionale della cella in un modo che ricorda l’immagine standard SEM can (un’eccellente immagine SEM rappresentativa di T. brucei può essere trovata a http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

Ovviamente, TEM avrà una risoluzione migliore, in generale, rispetto a wet SEM, ma le immagini presentate nell’esempio di T. brucei per confronto sono immagini “tipiche” ottenute nello stesso laboratorio., Poiché il wet SEM è diverso nella sua utilità rispetto al TEM e alla microscopia ottica, in T. brucei può essere visto come un’importante capacità complementare, e ci si può aspettare che il quadro completo sia dato da una combinazione di tecnica ottica, TEM e wet-SEM.

Sezioni di tessuto. Wet SEM può essere utilizzato per campioni spessi come frammenti di tessuto semplicemente montando il campione contro la membrana. La limitata profondità di campionamento delle BSE consente l’imaging di una “sezione virtuale”, che si estende dalla superficie a una profondità definita fino a pochi micrometri senza la necessità di sezioni sottili.,

Fig. 5 A e B mostra la visualizzazione diretta dei tessuti non trattati dal topo. Fico. 5A è un’immagine a piccolo ingrandimento del tessuto cardiaco. L’organizzazione delle cellule muscolari è evidente. Zoom su una cella (Fig. 5B) fornisce una visione vivida del nucleo e degli organelli intracellulari, possibilmente mitocondri, e della loro dispersione nella cellula. Come mostrato sopra per le cellule coltivate, la colorazione dei tessuti è vantaggiosa ma non imperativa e può migliorare la visualizzazione di molte caratteristiche. Fico. 5 C e D mostra una regione della corteccia renale di un ratto., La colorazione (ferricianuro di potassio) accentua l’organizzazione complessiva e i contatti cellulari all’interno degli epiteli dei tubuli renali. Un’attenta regolazione delle condizioni di colorazione e di imaging può rivelare informazioni diverse e complementari come l’architettura dei tessuti; ad esempio, i tessuti colorati con acetato di uranile producono un’immagine chiara della matrice extracellulare (dati non mostrati).

Raccolta simultanea di fotoni (CL). Il rilevamento della BSE nel SEM umido può essere integrato dalla raccolta simultanea di fotoni., Il fascio di elettroni a scansione eccita le molecole nel campione, che possono quindi emettere luce a lunghezze d’onda caratteristiche (CL). L’intensità della luce viene quindi utilizzata per ricavare un’immagine della distribuzione di molecole scintillanti, endogene alla cellula o etichette che possono essere introdotte esternamente. Questa immagine è ottenuta simultaneamente con l’imaging mediante BSE ad una risoluzione limitata dalle interazioni elettrone–materia e non dalla diffrazione della luce (6). Abbiamo inserito una guida di luce nel fluido sotto il campione, che guida la luce emessa ad un fotomoltiplicatore., Questa configurazione raggiunge un buon accoppiamento e una raccolta efficiente dei fotoni eccitati dal fascio di elettroni senza compromettere l’efficienza del rilevamento simultaneo di BSE.

Fig. 6 mostra le cellule CHO non trattate, visualizzate simultaneamente da BSE e fotoni. In Fig. 6A, i bordi delle cellule sono chiaramente delineati nella modalità di imaging elettronico e il nucleo (insieme ai suoi nucleoli) sono prominenti, così come le macchie scure ≈1-µm attorno al nucleo. Questi appaiono nel citoplasma di tutte le cellule eucariotiche che abbiamo studiato e, sebbene il loro numero vari, di solito sono dispersi attorno al nucleo., Nell’immagine CL mostrata in Fig. 6B, il contorno cellulare e il nucleo sono chiaramente definiti, indicativi di una distribuzione di molecole scintillanti (simile all’autofluorescenza) nella cellula. In questa modalità, gli stessi punti sono caratterizzati da un’elevata emissione di fotoni. La combinazione di un alto segnale catodoluminescente e alto contenuto di carbonio è tipica delle goccioline lipidiche (11), che partecipano allo stoccaggio di energia della cellula (12)., Un test indipendente di aggiunta di acido oleico 200 µM ha causato una forte proliferazione di queste goccioline nella cellula (dati non mostrati), coerente con l’idea che le macchie osservate siano goccioline lipidiche.

Il SEM bagnato ha un vantaggio rispetto alle tecniche SEM standard nella conservazione dei lipidi, specialmente in grandi aggregati come le goccioline lipidiche. Eliminando la necessità di essiccazione salva i lipidi dai solventi organici che possono dissolverli. Sebbene il trattamento con osmio conservi alcuni doppi strati lipidici, in aggregati più grandi l’osmio reagisce rapidamente per creare una crosta esterna che non lascia entrare l’osmio, lasciando gli aggregati vulnerabili al successivo trattamento organico-solvente., Nelle preparazioni criogeniche, la tendenza del processo di scissione a incrinarsi lungo i confini dell’acqua lipidica è anche un pericolo per le grandi strutture lipidiche.

L’imaging ad alta risoluzione dei marcatori è una capacità altamente desiderabile della modalità di rilevamento CL, che richiede lo sviluppo di etichette per molecole specifiche nelle cellule. In Fig. 9, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS, dimostriamo che le perle fluorescenti standard di 0,2 µm di diametro emettono fotoni intensamente sotto il fascio di elettroni e possono essere riprese con una risoluzione di ≈100 nm (7)., L’imaging di perle più piccole è limitato dalla bassa luminosità, che comporta lo sviluppo di perline di scintillazione specializzate a piccolo diametro . Poiché il meccanismo per l’eccitazione della scintillazione è più forte quando il fascio sta interferendo direttamente sul tallone, ci aspettiamo che questo possa estendere la risoluzione dell’imaging fluorescente di un ordine di grandezza oltre quello disponibile con la microscopia ottica.