Good Mood

Risultati e discussione

La libreria cDNA di Arabidopsis è stata sottoposta a screening utilizzando l’approccio di screening CaM-binding marcato con 35S come descritto (24). Uno dei cloni positivi ha mostrato una sequenza nucleotidica identica a AtCat3 nel database (GenBank accession no. U43147). Per dimostrare che AtCat3 ha codificato una proteina legante CAM, la regione codificante completa di AtCat3 è stata subclonata nel vettore di espressione pET14b. L’AtCat3 ricombinante è stato indotto da isopropil β-d-tiogalattoside (IPTG) (Fig., 1A) ed è stato purificato mediante cromatografia di affinità CaM a quasi omogeneità. Estratto batterico totale è stato utilizzato per il test CaM-binding, ed è stato dimostrato che 35S-marcato CAM si lega alla proteina AtCat3 in presenza di Ca2 + (Fig. 1 BIS). Dopo aver aggiunto EGTA, non è stata osservata alcuna associazione CAM. Inoltre, il CaM marcato con 35S non si legava ad AtCat3 quando CaCl2 veniva sostituito da altri cationi bivalenti come MgCl2 o MnCl2 (Fig. 1A), suggerendo che il legame CaM con AtCat3 dipende da Ca2+.

Per identificare l’area di legame CAM in AtCat3, sono stati utilizzati due mutanti di delezione C-terminale per i test di legame CAM 35S. In presenza di 0.,2 mM Ca2+, CaM si lega al tipo selvaggio e al mutante 1-451, mentre CaM non si lega al mutante 1-414 (Fig. 1B), suggerendo che la regione di legame CaM per AtCat3 è limitata agli aminoacidi 415-451. Per confermare ulteriormente il legame CaM con AtCat3, un peptide sintetico corrispondente agli amminoacidi 415-451 di AtCat3 è stato incubato con CAM. La formazione del complesso peptide-CaM è stata valutata da una PAGINA non indurente. Il peptide 36-mer è in grado di formare un complesso stabile con CAM in presenza di Ca2 + (Fig. 1C). In assenza di peptide, è stata osservata una singola banda camma., Man mano che la concentrazione di peptide aumentava, appariva un’altra banda con bassa mobilità, che rappresentava il complesso peptide-CaM. Quando il rapporto molare tra il peptide e CaM era 1:1, è stata rilevata solo la banda complessa peptide-CaM, indicando che esiste un solo sito di legame CAM nel peptide. Nessun complesso di peptide-CaM è stato formato alla presenza di EGTA (il fico. 1C). Questi risultati indicano che CaM si lega specificamente all’AtCat3 in modo calcio-dipendente.

La catalasi esiste in quasi tutti gli organismi aerobici. Negli animali, c’è solo una isoforma catalasi codificata da un singolo gene., Al contrario, la catalasi nelle piante è presente come isoforme multiple codificate da una piccola famiglia di geni (6, 26). Almeno questo è vero in monocotiledoni come mais e dicotiledoni come tabacco, Arabidopsis e zucca, in cui la catalasi è ben caratterizzata. È interessante notare che ognuno di essi ha tre isoforme codificate da tre geni. Per determinare se tutte le catalasi hanno le regioni di legame CaM, le sequenze aminoacidiche di 37 catalasi di batteri, animali e piante sono state confrontate utilizzando il programma pileup nel pacchetto GCG10., Il confronto della sequenza aminoacidica ha rivelato un’omologia molto elevata nell’N-terminale 384 aa (circa il 60% di somiglianza e il 50% di identità). Tuttavia, nel C-terminale 108 aa, dove si trova la regione di legame CaM, c’era pochissima somiglianza tra AtCat3 e altri catalasi non vegetali (circa il 21% di omologia e il 14% di identità). Tuttavia, tutte le catalasi vegetali hanno mostrato un’elevata omologia in questa porzione (circa il 78% di omologia e il 70% di identità), in particolare nella regione corrispondente all’area di legame CaM in AtCat3. Fico. 2 mostra il confronto di sequenza C-terminale 108-aa di 13 catalasi rappresentativi., Sebbene le sequenze aminoacidiche nelle proteine di legame CAM caratterizzate non siano conservate nella regione di legame CaM, la maggior parte di esse ha una caratteristica strutturale secondaria, l’α-elica anfifilica di base (27), come la proteina regolata dall’auxina ZmSAUR1 (24) e la proteina chimerica Ca2+/CAM chinasi vegetale (28). Si noti che ci sono spesso aminoacidi caricati negativamente nelle regioni di legame CaM, ma la carica netta è positiva (16). Sulla base della proiezione della ruota elicoidale utilizzando il programma GCG, è stato determinato che gli amminoacidi 438-451 in AtCat3 sono in grado di formare un’α-elica anfifilica di base., È chiaro che un lato della ruota elicoidale è idrofobo e l’altro lato è idrofilo con cariche positive nette. L’analisi delle sequenze aminoacidiche corrispondenti alla regione di legame CaM di AtCat3 ha predetto l’esistenza di una α-elica anfifilica di base in alcune delle altre catalasi vegetali. È interessante notare che tra tre isoforme catalasi in mais, tabacco, Arabidopsis e zucca, c’è almeno una isoforma con la struttura α-elicoidale anfifilica in ogni specie, ad esempio,, tabacco1 (amminoacidi 431-444), maize3 (amminoacidi 442-455) e pumpkin1 (amminoacidi 438-451), così come Arabidopsis AtCat1 (amminoacidi 438-451). Se sia vero per tutte le specie vegetali non è chiaro a causa delle sequenze di catalasi limitate per altre specie vegetali in GenBank. Sulla base dei dati della struttura cristallina delle catalasi batteriche e dei mammiferi, le α-eliche sono le strutture tipiche nella porzione C-terminale di queste catalasi (29), ma nessuna struttura α-elicoidale anfifilica di base esiste in questa porzione secondo la proiezione della ruota elicoidale.,

Per verificare se CaM si lega alla catalasi purificata da planta, la catalasi del tabacco è stata purificata dalle foglie a base di Durner e Klessig (10). Una colonna CAM-sepharose è stata utilizzata come ultima fase del processo di purificazione. Il riassunto delle fasi di purificazione della catalasi utilizzando 1.000 g di foglie di tabacco è presentato nella Tabella 1. La catalasi del tabacco è stata purificata fino a quasi omogeneità come giudicato dalla SDS / PAGE e dalla colorazione argento (Fig. 3, corsia 1). L’identità della catalasi è stata confermata da Western blotting con un mAb contro la catalasi del tabacco (Fig. 3, corsia 3)., Il legame CaM alla catalasi del tabacco purificata è stato dimostrato dai seguenti approcci. – Una colonna CAM-sefarosio è stata utilizzata per la purificazione della catalasi del tabacco. Il tasso di recupero per questo passaggio è stato dell ‘ 81% (Tabella 1), suggerendo che la maggior parte della catalasi delle foglie di tabacco è una proteina legante CAM. (ii) CAM 35S-marcato è stato utilizzato per testare il legame alla catalasi purificata in presenza di 0,2 mm CaCl2 (Fig. 3, corsia 5). L’AtCat3 ricombinante è stato usato come controllo (Fig. 3, corsie 2, 4 e 6). Aggiunta di 0.,4 mm EGTA abolito CAM binding, suggerendo che CaM si lega alla catalasi vegetale in modo Ca2 + – dipendente. Sono stati effettuati anche saggi di legame CaM per determinare se si lega alla catalasi fungina, bovina o umana. I risultati hanno rivelato che nessuna di queste catalasi non vegetali ha mostrato alcun legame CaM (dati non mostrati), che è in accordo con i confronti della sequenza aminoacidica (Fig. 2).,

Il sito di legame CAM o le regioni strettamente giustapposte in altre proteine di legame CAM caratterizzate spesso funzionano come domini autoinibitori o pseudosubstrati. Questa regione mantiene le proteine bersaglio in uno stato inattivo in assenza di segnale Ca2+, come nella proteina chinasi chimerica Ca2+/CaM-dipendente (30) e nella decarbossilasi del glutammato (31). Per studiare il significato del legame CaM alle catalasi vegetali, sono state misurate le attività catalitiche dell’AtCat3 ricombinante e della catalasi del tabacco purificata in presenza e assenza di CaCl2 e CaM., Esperimenti simili sono stati effettuati anche utilizzando altri catalasi non vegetali. L’AtCat3 ricombinante espresso da E. coli non ha mostrato attività. Risultati simili sono stati ottenuti in un altro laboratorio (Zhixiang Chen, comunicazione personale). Ciò potrebbe essere il risultato della mancata formazione della struttura corretta per la catalasi ricombinante, poiché la catalasi attiva è un tetramero costituito da quattro subunità identiche o simili (6, 10, 26). Al contrario, la catalasi del tabacco purificata ha mostrato un significativo cambiamento di attività Ca2+/CaM-dipendente durante le fasi di purificazione (Tabella 1)., Gli effetti stimolatori di Ca2 + / CaM sono circa 2,2 volte in ogni fase, tranne il campione che è stato ottenuto dopo la cromatografia CAM-sepharose. Ha mostrato una maggiore stimolazione dell’attività della catalasi (2,5 volte) probabilmente a causa della rimozione della frazione catalasi non Ca2+/CaM (Tabella 1). La frazione catalasi non-Ca2+/CaM-binding aveva un’attività specifica di 59,6 unità (attività basale). Tuttavia, Ca2 + / CaM non ha stimolato l’attività di questa frazione di catalasi (dati non mostrati)., Questi risultati indicano che Ca2 + / CaM è in grado di attivare la catalasi del tabacco nella frazione ottenuta dopo cromatografia CAM-sepharose, che corrisponde ai risultati del legame CAM. Per confrontare gli effetti di Ca2 + / CaM sull’attività delle catalasi provenienti da fonti diverse, è stata utilizzata l’attività relativa, poiché vi è una differenza significativa nell’attività specifica delle catalasi di specie diverse. Ad esempio, A. niger catalase ha l’attività specifica di 5,7 unità; catalasi epatica bovina, 51,9 unità; eritrociti umani, 39,5 unità; catalasi del tabacco, 63.,1 unità (in assenza di Ca2 + / CaM). Fico. 4A mostra che CaCl2 da solo o CaM da solo non hanno avuto alcun effetto stimolante sull’attività della catalasi del tabacco (circa il 40% dell’attività massima). Nessuna differenza nell’attività catalitica è stata osservata nelle catalasi fungine, bovine o umane in presenza o assenza di Ca2+, CaM e Ca2 + / CaM (Fig. 4 BIS). Sostituendo CaCl2 con MgCl2, non vi è stato alcun cambiamento significativo nell’attività della catalasi del tabacco in presenza o assenza di CaM (dati non mostrati)., Per documentare ulteriormente l’effetto di Ca2+/CaM sull’attività della catalasi vegetale, 10 µM del peptide corrispondente alla regione di legame CAM AtCat3 (415-451) sono stati aggiunti a ciascuna miscela di reazione. Le catalasi non vegetali non sono state influenzate dall’aggiunta del peptide. Tuttavia, l’effetto stimolante di Ca2 + / CaM sull’attività della catalasi del tabacco è stato abolito dall’aggiunta del peptide (Fig. 4 BIS). Inoltre, l’effetto inibitorio del peptide sull’attività della catalasi del tabacco dipendeva dalla concentrazione del peptide (Fig. 4 TER)., L’attività della catalasi è stata inibita di circa il 58%, che è vicina all’attività basale della catalasi. Tuttavia, il peptide non ha avuto alcun effetto sull’attività della catalasi bovina a tutte le concentrazioni testate (Fig. 4 BIS). Questi risultati suggeriscono che Ca2 + / CaM ha un effetto stimolante sulla catalasi vegetale purificata, ma non ha alcun effetto sulle catalasi non vegetali.

È noto che la catalasi è un enzima perossisomiale predominante, ma esiste anche nei mitocondri e nel citoplasma (32). Ad esempio, il mais Cat3, che potrebbe essere una catalasi legante CAM basata sul confronto delle sequenze di aminoacidi, è una proteina mitocondriale (33). I nostri risultati (Fig. 1-4) dimostrare che CaM si lega alla catalasi vegetale e regola la sua attività. Per dimostrare la presenza di questa attività regolatoria in vivo, abbiamo studiato se CaM coesiste con catalasi nei perossisomi delle piante., Gli organelli degli estratti di cotiledoni di zucca etiolati sono stati separati mediante centrifugazione a densità di saccarosio. Per rimuovere la contaminazione delle proteine citosoliche che potrebbero essere presenti nella soluzione o semplicemente associate alla membrana perossisomiale, i perossisomi isolati sono stati trattati con proteinasi K. In questo modo, le proteine perossisomali schermate dalla proteasi dalla membrana perossisomiale non sono state digerite (34, 35). L’identità delle frazioni perossisomiali è stata dimostrata misurando l’attività della catalasi (35)., CaM è molto conservato in tutti i regni (13-16), quindi abbiamo fatto analisi occidentali con un anticorpo CaM anti-umano. Come controllo, è stata utilizzata la camma di patate ricombinante PCM6 (Fig. 5, corsia 3). È interessante notare che una banda di dimensioni simili a PCM6 era presente nelle frazioni perossisomiali, ma l’intensità era notevolmente inferiore rispetto alla CAM citosolica (Fig. 5). Questi risultati indicano che CaM e catalasi sono colocalizzati nei perossisomi. CaM è una piccola proteina acida che si esprime principalmente nel citoplasma., Tuttavia, nelle piante, CaM ha dimostrato di essere presente in diversi organelli come il nucleo e i cloroplasti (36, 37) e la matrice extracellulare (38). Inoltre, le proteine regolate da CaM esistono nella matrice extracellulare, nel nucleo e nei cloroplasti (38-40). Come CAM attraversa la membrana non è chiaro. Studi recenti indicano che le modifiche post-traduttive svolgono un ruolo nella traslocazione di alcune isoforme CAM. Ad esempio, una proteina simile alla petunia CAM, CaM53, è associata alla membrana plasmatica quando la proteina è prenilata. Se la prenilazione è inibita, CaM53 si trova prevalentemente nel nucleo (41).,

A nostra conoscenza, non esiste un rapporto che discute la concentrazione di calcio nei perossisomi., Sulla base di un recente modello modificato della biogenesi del perossisoma, il perossisoma origina dal reticolo endoplasmatico (ER) per mezzo di vescicole preperossisomiali (42). È noto che l’ER è uno dei pool intracellulari di calcio. Pertanto, la concentrazione di calcio nei perossisomi potrebbe essere elevata come nel pronto soccorso. Misurare la concentrazione di calcio perossisomiale e monitorare qualsiasi legame tra il cambiamento della concentrazione di calcio nel citoplasma e nel perossisoma dovrebbe aiutare nella nostra comprensione di come la catalasi perossisomiale è regolata da Ca2+/CaM., Ad esempio, la concentrazione di calcio libero potrebbe essere misurata nelle piante transgeniche con l’aequorina ricostituita con un segnale di targeting perossisoma. L’aequorina è una proteina luminescente sensibile al calcio, la cui luminescenza riporta direttamente la variazione del calcio (43). Poiché il perossisoma è un importante organello che rimuove il ROS tossico, principalmente H2O2, è ragionevole ipotizzare che l’attività della catalasi perossisomiale rimanga elevata per tutto il tempo per degradare H2O2 in situ ad un ritmo rapido. Tuttavia, le fluttuazioni del calcio citosolico potrebbero avere un effetto importante sull’attività della catalasi citosolica., È importante sottolineare che non tutte le catalasi sono proteine leganti la camma. Quindi, sono necessarie ulteriori indagini per affrontare il significato di Ca2+/CaM nel controllo dell’attività della catalasi in diversi organelli.

Gli stress biotici e abiotici innescano un afflusso di Ca2 + e l’aumento di Ca2 + citosolico stimola la produzione di H2O2, che si diffonde nelle cellule circostanti come messaggero e induce la risposta fisiologica (19, 20). I nostri risultati suggeriscono che un aumento di Ca2 + citosolico può ridurre i livelli di H2O2 mediante la stimolazione Ca2 + / CaM-mediata dell’attività della catalasi (Fig. 4)., Proponiamo che l’aumento del Ca2 + citosolico abbia un duplice ruolo nella regolazione dell’omeostasi H2O2 (Fig. 6): (i) la regolazione positiva genera H2O2 attivando direttamente la NADPH ossidasi, che ha affinità con Ca2+ (22) e producendo indirettamente più NADPH per mezzo della chinasi NAD regolata da Ca2+/CaM (23); e (ii) la regolazione negativa riduce H2O2 stimolando l’attività della catalasi attraverso la modulazione Ca2+/CaM (Fig. 4)., I cambiamenti indotti dal segnale nei transienti Ca2 + possono differire nella frequenza, durata, ampiezza e localizzazione spaziale delle oscillazioni e modalità di propagazione spaziale, che porta ad effetti differenziali sulle proteine bersaglio del calcio (12, 44).