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牛乳収量に対するrbSTの影響

表2は、各処理サイクルにおける牛乳生産(Kg/日)の平均および標準偏差として表されるrbSTおよび対照群の牛乳収量の概要を示している。グループ（対照動物と比較してrbstグループによって産生された余分なミルクの％）。, からのサイクル0-サイクル3の牛乳の生産量が増えそうになることを示す動物には至っていないピークに達し乳. RbSTの最初の線量はおよそ2か月のpost-partum管理されたが、製造業者によって推薦されるように、この推薦が産後60-90日に牛乳生産のピークを見つける数学モデルに基づいていることに注意することは重要である。, しかし、これらのモデルは理論的なアプローチに過ぎず、牛乳ピーク時の牛乳（DIM）の日数は、他の要因の中でも、福祉と給餌によって調整され、群れと牛の間で広い変化を持っている37。 サイクル4から研究の終わりまで、対照牛の牛乳生産の減少は垣間見ることができたが、rbST処理動物は一日あたりの牛乳の平均30-35kgで比較的一定, この時点で、グループ間で観察された生産差は、サイクル0で観察されたものに非常に近いレベルに戻った。 これは、これらの動物が対照被験者よりもわずか6％多くを生産していたサイクル中を除いて、研究全体の間にrbST群で牛乳生産が対照よりも有意に高かったという事実を驚くべきことである（表2）。 製造業者によって推奨されるrbSTの隔週投与パターンに基づいて、70日目に、治療された動物群は、組換え成長ホルモンの新しい用量を受けるべきである。, しかし、rbST群がホルモン投与なしで28日後に用量前転写プロファイルを回復できるかどうかを評価できるように、その用量は適用されなかった（Fig. 1). おそらく、このホルモンの欠如のために、両群間の牛乳生産に存在する統計的に有意な差は消失し、牛乳生産率に対するrbSTの影響を強調した（表2）。 84日目に、rbSTを再度投与し、両群間の牛乳生産の有意な差が再び現れた（24％）。, 対照牛に関して処理された動物における43％以上のミルクの最大差は、rbSTによる維持生産と対照女性の自然な減少パターンに関連する両方のサイクル12 不思議なことに、これらの有意差は、最後の用量（第12回用量、168日目）が投与されたほぼ二ヶ月後であっても、研究の終わりまで維持された（表2）。

ウシ体細胞からのRNA単離

Mscは、これらの細胞は非常に簡単なプロトコルに従って生乳から単離することができるため、gene現研究 その上、サンプルコレクションは従ってミルクが動物が付いている直接接触なしで搾り出す部屋で得られた結果を変えることができるそれに圧力をもたらさないで集めることができるので、安く、非侵襲的です。 この研究では、rbST治療は有意な効果をもたらさなかった（P=0。,099)MSCsから単離されたRNAの量について、rbST群からのサンプルにおける平均濃度は120.69±68.31μg mL−1であり、対照群からのサンプルにおける132.36±68.86μg mL−1 平均A260/280比値は1.766±0.095であった。 スピンカラムを用いた精製ステップは、A260/280比を増加させ、したがってRNAサンプルの純度を増加させる可能性がある。 このステップの包含は定期的な分析のサンプル価格を高めるが、より高い純度のサンプルを得ることを可能にする。 分析されたサンプルについて観察された平均RIN値は6.88±0であった。,82いくつかの要因がサンプルの完全性に影響を与える可能性があります。 この研究で使用した試料は、ミルクから単離されたウシ体細胞であった。 ミルクは、複雑な微生物叢によって特徴付けられ、その微生物叢に由来するRnaseは、より低いRNA完全性の原因である可能性がある。 さらに、乳中に存在する体細胞のいくつかは、部分的に分解される可能性がある。 これらの事実はまた同化agents38の誤用をたどるとbiomarkersを見つけるように目的のtranscriptomicsの調査のために牛のような腟の汚れを使用した調査で観察されました。, また、搾乳、牛乳の収集、および実験室への輸送のプロセスは、できるだけ迅速に実施されているにもかかわらず、RNAの完全性に影響を及ぼす可能性があ

体性トロピック軸遺伝子に対するrbSTの効果

この研究で使用されるOpenArray®プレートを設計するために、18個の遺伝子（表1）のセットを選択しました。 この選択は、乳牛におけるrbSTのab（使用）を制御するための標準として使用することができる特徴的なrbST転写シグネチャを得るために、これらの遺伝子の, RbSTを用いた以前のgene現研究は、死後の乳房組織27またはvivo31における血液および筋肉サンプリングを用いたマルチ用量（五用量）研究における単回用量および単一サンプリング研究として設計された。 の方法と侵襲性があり、比較的高価なため、非現実的制御を目的に酪農場となっています。 ソマトトロピンの場合、究極の目標はrbSTミルクの乳製品市場への参入を避けることであるため、コントロールはin vivoで行われなければならない。,

本研究では、IGF-1の発現はrbSTで処理された牛（牛7）のすべてのサンプル点でのみ検出され、対照群のMSCsでは検出されなかった。 一つの牛のすべてのサンプルポイントでIGF-1ターゲットを検出することのみが可能であったという事実は、個人間の外因性rbSTに対する異なる局所乳腺応答の存在を示している可能性がある。 循環で見つかったほとんどのIGF-1分子は、ターゲットtissues39におけるIGF-1の生物学的利用能を調節する六つの既知のIGF-1結合タンパク質（IGFBP–1-6）の一つ以上に高い親和性でバインドされています。, 以前の研究では、rbSTが強くcattle31の骨格筋におけるIGFBP-3のアップレギュレーションに影響を与え、乳腺組織におけるIGFBP-3をダウンレギュレーションすることを観察している32。 しかし、本研究では、どちらもIGFBP-3もIGFBP-5の転写産物は、任意の時点で検出されませんでした。 この結果は、MSCsが主に白血球40で構成されているため、IGFBPの抑制効果は乳腺組織ほど重要ではない可能性があるためである可能性があります。 したがって、IGF-1およびIGF-1結合タンパク質の両方が、本研究では体細胞における潜在的なマーカーとして廃棄される。,

somatotropic軸線のもう一つの主要コンポーネントは生物学的効果のほとんどを仲介するIGF-1のための第一次信号を送る受容器のIGF-1受容器（IGF-1R）です。 1日目にrbST群（0.348±0.131）は有意に（P<0.001）対照群（0.0898±0.0486）よりもIGF-1Rの高い相対存在量を有していた。 投与後の血液中のrbSTの濃度を評価した異なる研究は、この組換えホルモンのより高い濃度がrbST投与後に見出されたことを観察した14、15。, 従って、扱われたグループで観察される重要な相違は応答として最初の線量の管理の後で扱われた牛のrbSTの高い濃度として総合されるIGF-1への応答 である。 図2に示すように、rbST投与の二つの最初のサイクルに対するIGF-1Rの相対存在量も、多くのサンプルポイントにおいて対照群よりもrbST群で有意に高かったことが観察される。 不思議なことに、研究の84日目に、IGF-1Rの相対的な存在量は、rbST群（0.070±0.057）および対照群（0.110±0.030）で類似していた。, この日はrbSTの第六投与と一致し、この用量と第五用量の間には28日の代わりに14日のギャップがあった。 したがって、rbST群はrbSTなしで数日後にIGF-1Rの生理学的レベルを回復し、IGF-1R転写に対するダウンレギュレーションの離脱効果さえ示す可能性がある。 これらの結果は、IGF-1Rが酪農場におけるrbSTの使用を検出するための遺伝子のパネルに含めるための可能な良い候補であることを示している。, 他の著者は、骨格筋におけるIGF-1Rレベルに対するrbSTの有意な効果を見出さなかったが31、この研究では、MSCsにおけるこの受容体転写産物のレベルで明らかな応答が観察された。 この意味で、白血球、好中球および単球は、成長ホルモンおよびIGF-1を産生し、IGF-1/IGF-1Rシグナル伝達経路が免疫細胞増殖を含む免疫系に調節機能を発揮する可能性があることを示す受容体を発現することができる41、42。 二つの研究の違いは、使用される異なる行列によるものである可能性があります。, MSCsは、おそらく循環IGF-1のより高いレベルによりよく応答し、その膜中のこの分子の受容体の数を増加させることができます

免疫系関連遺伝子に対するrbSTの効果

腫瘍壊死因子（TNF）とインターロイキン-1β（IL-1β）は、免疫系に密接に関連する二つのサイトカイン43である。, おそらくそれらの関係のために、研究を通じてTNFおよびIL-1β転写産物の相対的な存在量における同様の傾向を同定することが可能であった。 RbST投与は、TNFおよびIL-1β転写産物の相対的な存在量の有意な増加を引き起こした。 9日目、23日目および35日目において、TNFおよびIL-1βの相対存在量は対照群と比較してrbST群で有意に高かったことに言及する価値がある（Fig. 3). これらの日は、rbSTサイクルの第二週に対応します,ラクトトロピナの注射後約7-9日®., したがって、これら二つのサイトカインにおけるrbSTによって引き起こされるトランスクリプトームの変化は、rbSTサイクルの第二週により明らかである 不思議なことに、84日目（28日rbST投与後5日目）では、グループ間に有意差はなかった（図。 3). この文脈では、他の前の調査はcattle26、38の同化代理店の使用を検出するのに強力なtranscriptomic技術を使用しました。, これらの研究はまた、IL-1βの転写の増加を観察し、そのうちの一つは有意に26であり、参照された研究は、白血球の割合が高いため、MSCsの組成と非常によく似ている血液細胞を使用していたため、これは非常に興味深いものである。 但し、前述の調査は現在の研究はTNFの相対的な豊富のrbSTの管理の強い影響を見つけたが、TNFに対する同化代理店の効果を見つけませんでした。, これに関して、授乳中のrbSTの外因性投与は、牛の免疫応答を増強することができることが報告されている44。 実際には、rbSTを投与したときに大腸菌類乳房炎に罹患している牛では、乳体細胞数が早くかつ速く増加した45。 成長ホルモンおよび組換え版は健康および病気にかかった牛のような泌乳の乳腺の炎症性反作用そして好中球の防衛を調整する機能を示します45。 これは、rbST処理牛におけるTNFおよびIL-1βのアップレギュレーションを説明することができる。,

トランスクリプトミクスを用いたスクリーニング研究では、非常に信頼できる遺伝子として使用できる特定の遺伝子を見つけることは非常に困難 IL-1βおよびTNFの両方が、他のプロセスにおいて亜臨床乳房炎46,47として上方制御され得ることに留意すべきである。 米国で行われたさまざまな研究では、大規模な農場がrbSTを採用する可能性が高いことが観察されており、rbSTの使用と収益性の潜在的な農場サイズのコンポーネントだけでなく、オペレータ（年齢と教育）component48、49も示唆されている。, 組換えのsomatotropinはより大きい農場に特徴である管理練習および他の生産性指向の技術の使用と関連付けられる管理集約的な技術として頻繁に報告され、grazers49、50間でより少なく頻繁です。 この意味で、無症候性乳房炎は、罹患した牛の牛乳生産の減少を引き起こす51。 したがって、転写アッセイのデータと牛乳生産データを組み合わせることは興味深いはずです。, また疑われた牛のミルクの微生物学的な試金と一緒に無症状の乳房炎と関連付けられる主な病原体を検出することを伴うことができます。 しかし、本当に差別の可能性を高めるのは、パネルにより多くの遺伝子を含めることです。

細胞周期、増殖、分化および接着に対するrbSTの効果

rbSTが乳腺上皮細胞のターンオーバー（増殖/アポトーシス）および活性を増加させることによって乳汁合成を増加させることが知られており、rbSTが細胞ターンオーバー/サイクルおよび代謝を調節する代謝経路に影響を及ぼすことを示している52。, 細胞周期はサイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼによって制御される。 これらのうち、サイクリンD（CCND1遺伝子によってエンドドードされた）は、細胞外刺激（例えば、成長因子、栄養素の可用性）を介して細胞周期の進行を調整し、G1をs期の進行にドライブし、細胞有糸分裂をもたらす。 しかし、ほとんどの成体細胞は、g0期、安静状態として知られている静止状態に維持され、それらは適切な有糸分裂性stimuli53の下でG1期に細胞周期に再 本研究では、rbST処理がCCND1転写に強く影響することが観察された。, RbSTの最初の投与前には、対照群とrbST群の間に有意差はなかった（図。 3). しかし、最初の投与後、異なるサンプルポイントで二つのグループ間の有意差を観察することが可能であった。 CCND1の相対的存在量は、rbST治療の二つの最初のサイクルにおいて対照群よりもrbST群で有意に高かった（図。 2). この効果は、TNFおよびIL-1β転写産物と同様に、rbST投与の9日後に特に顕著であると思われる。, したがって、研究の9日目、23日目および35日目に、CCND1の相対的存在量は、対照群よりもrbST群で有意に高かった（Fig. 3). 最後に、84日目（第28回rbST投与後5日目）では、グループ間に有意差はなかった（図。 3）サイトカインの場合と同様に。 また、サンプリングの最終日（219）（最後のrbST投与後51日）では、rbST群（0.433±0.141）と対照群（0.430±0.178）の間に有意差はなかった（P>0.05）。, したがって、rbSTの外因性投与はCCND1の過剰発現を引き起こす。 これは、G0期における細胞の活性化をもたらし、乳腺組織の特定の場合には、乳腺の肺胞細胞の数を増加させることによる牛乳生産の増加をもたらすことができる54。

細胞周期に関連する他の遺伝子は、腫瘍タンパク質D52様2（TPD52L2）およびサーチュイン2（SIRT2）である。 CCND1、TNFおよびIL-1βについて観察されたものと同様の方法で、rbST群におけるSIRT2転写産物の相対的な存在量が有意に高い（P<0.001）こ,517±0.199)対照群よりも(0.506±0.250)研究の23日目に,しかし、この場合にはちょうどrbST投与の第二サイクルの間に(図. 4). Lactotropinaの第二投与後のCCND1およびSIRT2転写産物のレベルの増加®治療群における細胞周期に対する外因性rbSTの効果の結果である可能性がある。 生物におけるこのペプチドホルモンの循環は、標的細胞における細胞周期の活性化をもたらすであろう。, しかし、他のrbSTサイクルでは、用量投与とSIRT2転写産物の相対的な存在量の変化との関係は、第二用量ほど明らかではなかった。 上記に加えて、治療群がTPD52L2転写産物の有意に高い相対的存在量（P<0.05）を最初のrbST投与後4日間に提示したことは注目に値する。 翻訳におけるその関連する役割によって細胞代謝に関与する別のコンポーネントは、真核生物伸長因子1ガンマ（EEF1G）である。,

この研究では、EEF1G転写産物の相対的な存在量は、rbST投与に関連する明らかな傾向に従わなかった。, しかし、17日目および30日目（それぞれ第二および第三rbST投与後3および2日）に、EEF1G転写産物の相対的な存在量はrbST群で有意に高かった。 以前の研究27は、rbST治療は乳腺組織におけるEEF1G転写産物のレベルを増加させると結論したが、ソマトトロピン投与から6日後に一つのサンプルポイントしか使用しなかった。 したがって、これらの結果を本研究で得られた結果と直接比較することはできず、36サンプルポイントを8ヶ月間にわたってトランスクリプトミックアッセイに使用した。, この研究に含まれるもう一つの遺伝子は、乳脂肪小球-EGF因子8タンパク質（MFGE8）である。 である。 図4に示すように、rbST群におけるMFGE8の相対的な存在量は、サンプリング日間大きな変動を有することを観察することが可能である。 特に、Ｍｃｃｏａｒｄ ｅｔ ａｌ．27は、rbST投与後6日、ウシ乳腺組織におけるMFGE8の相対的な存在量が高かったことを観察した。 しかし、前に述べたように、その研究は、単一のrbST投与後に唯一のデータポイントを含んでいました。, 現在の長期マルチ用量実験は、rbSTで処理されたウシ動物における転写パターンが時間の経過とともに大きな変動を有することを実証している。 例えば、CCND1について得られたデータは、いくつかの遺伝子の転写に対するrbSTの効果が用量の数とともに増加することを示した。 RbSTはMFGE8遺伝子の転写に影響を与える可能性がありますが、得られた結果は、アップとダウンレギュレーションの両方を示しました。, したがって、MFGE8は、その転写における明確な傾向を観察することができなかったので、牛におけるrbST（ab）使用を追跡するための理想的な候補として示唆 この研究で評価された細胞接着に関連する別の遺伝子は、カテニンα様1（CTNNAL1）である。 しかし，ｒｂｓｔ投与の結果，その転写に有意差を認めることはできなかった。

その他の遺伝子

ラクトフェリン（LTF）は、トランスフェリンファミリーに属する鉄結合糖タンパク質である55。, 図4は、この研究で評価されたすべてのサンプルポイントでのLTF遺伝子の相対存在量の進化を示しています。 LTFのアップレギュレーションはcattle38の同化物質との前の調査で観察されたが、rbSTの処置に関連してLTFのための明確な傾向を確立することは可能ではな 例えば、9日目および53日目では、rbST処理動物におけるLTFの相対的な存在量はかなり低い。 しかし、91日目には、相対的な豊富さはそのグループでかなり高かった。 コラーゲンIII型α1(COL3A1)遺伝子について得られた結果を議論する必要がある。, 以前の研究では、乳牛におけるrbSTによる治療は、rbST投与後6日後の乳腺組織におけるCOL3A1遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすと結論付けた27。 しかしながら、本研究では、COL3A1遺伝子の転写産物を検出することは不可能であった。 また、ESR2転写は本研究では検出されなかった。

乳牛におけるrbST（ab）の使用を監視する遺伝子のパネル

この仕事の最終的な目的は、その組み合わせ転写パターンMSCsを介して酪農場におけるrbSTの誤用を制御するためのスクリーニング方法の開発を可能にする遺伝子のルーチンパネルを提案することでした。, 他の以前の研究27、31、32とは異なり、この作品は、rbST投与と対照動物の8サイクルを含む12ヶ月の実条件実験でrbST関連遺伝子の転写パターンを分析した。 このアプローチにより、rbST処理牛と対照牛を区別するために、より正確なデータを得ることができました。

rbST投与の結果としてMSCs転写パターンの修飾を解明するために多変量統計解析を実行しました。, この目的のために、実験全体にわたって正常に測定された九つの遺伝子（IGF1R、CCND1、TNF、Il1β、SIRT2、EEFG1、MFEG8、LTF、TDP52L2）の転写産物のみが使用され、ごく少数のケース/サンプルでのみ発現する遺伝子を除いて使用された。 PCA解析の主な目的は、異なる変数間の相関、すなわちこの特定のケースでは、異なる遺伝子の転写を検出し、データ内のグローバルパターンを同定することです。, 主成分（PCs）の新しい多次元空間へのサンプルの投影は、潜在的にrbSTと対照群との間の分化を可能にし、治療のバイオマーカーとしてより大きな能力を持つ ＰＣＡ分析のスコアプロットにおいて、図に示す。 5、グループ化傾向は、rbST処理動物が赤い円として識別され、対照動物がブラックボックスとして識別され、実験日に応じて標識されたMSCサンプルの二つのグループに垣間見ることができます。, RbST群の様々なサンプルは、プロットの左側のコントロールと混合して現れたが、不思議なことに、それらの大部分は、ソマトトロピン投与の日（14日、28日、57または84日）または投与後の最初の2-3日（2日、3日、17日、44または115日）に対応しており、明らかな転写障害は検出されなかった。 逆に、PCA上で処理された牛として分類することができる対照動物はごくわずかであり、その状況は、LTF、MFGE8またはSIRT2のような特に差別性の低い遺伝子の極端な値によって説明される。,

転写プロファイルはまた、潜在的な弁別遺伝子も指摘されたOPLS-DAに供された。 である。 図6aに示すように、多変量モデルの視覚的表現が示され、対照動物からのMSCサンプルは黒い四角としてプロットされ、rbSTグループからのサンプルは赤 PCAと同様の方法で、いくつかのrbSTサンプルが楕円の左側にある対照サンプルの間に投影されます。, しかし、これらのサンプルは、rbSTによって引き起こされた転写障害が消失した（またはまだ現れていなかった）ときに収集されたので、厳密には、その特定の瞬間に対照として分類することができた。 逆に、非常に少数の対照サンプルがrbSTとして誤分類された。 この場合のようにテストセットが利用できない場合、交差検証法はモデルの品質を評価するための主な戦略です。 交差検証手順の結果は、異なる品質パラメータの値によって要約される。, 本研究では、OPLS多変量モデルは、R2（X）=0.6、R2（Y）=0.4およびQ2=0.3の特性を示した。 このモデルは、x空間の変動の60％とy空間の変動の40％を説明し、予測の良さは30％です。 これらの値は、モデルおよび平均予測可能性によるデータの比較的良好な記述を示しています34。 CV-ANOVAから計算されたp値は3.01×10-7であり、モデルの二つのクラスの間に有意な差が存在することを示唆している。, このモデルが異なる識別能力を有する遺伝子のパネルで構築されたという事実は、OPLSの識別力に影響するので、無視されるべきではない。 さらに、転写産物にrbST効果がほとんどまたはまったくない実験日は、実際にはあるグループに属しているが、他のグループとして機能するため、モデルにバイアスをかけています。, 将来の多変量スクリーニングモデルでは、選択された高度に識別可能な遺伝子のパネルを使用する必要があり、好ましくは、多変量モデルに投影される”既知”および”未知”サンプルは、同様の集団（年齢、品種など）に属するであろう。）および泌乳の瞬間、個々の動物間の可変性を克服する試み35。 この種のアプローチでは、予測母集団が予測された標本よりも大きいことも重要です。 最後に，ＯＰＬＳ-ＤＡに関する識別の理由を対応するＳプロットで調べた（Fig., 6b)は、二つのサンプルクラスの分離に対する各変数（遺伝子転写）の寄与を明らかにした。 前のセクションでコメントしたように、MSCにおける最も判別的な転写は、CCND1、IGF-1R、TNFおよびIL-1β遺伝子において見出された。 RbST治療がこれらの遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすことは明らかであり、将来のモニタリングパネルでは乳製品におけるルーチン制御の,

この遺伝子パネルでrbSTの違法な使用を検出するためのルーチンコントロールのように、牛が治療された時期についての情報はない（他の言葉では、それは盲目のアッセイである）、理想的には授乳中の毎日をサンプリング/制御する必要があります。 しかし、実用的な観点からは、この提案は少し非現実的に聞こえます。 それが提案されているのは、週に一度のミルクのランダムなコレクションであり、曜日を交互に, ソマトトロピンは、授乳中（産後80-100日、隔週開始）に定期的に投与されるので、農場のすべての授乳牛において、良好なサンプリング計画で、ある時点でrbSTを農場で検出すべきである。 収集されたサンプルから得られた転写データは、対照集団からの転写データセットと比較されなければならない。 この論文で提案された遺伝子の高い値を提示したサンプルは、疑わしいとみなされるべきである。 第二段階は、それぞれの”陽性”牛（乳房炎、妊娠など）の特定の状況を調査する必要があります。,必要であれば、確認分析を継続する。 このリアルタイムＰＣＲアプローチの高スループット容量を強調し，サンプリング計画を実現可能にすることが重要である。