Good Mood

それはあなたがしなければならない他のすべてに加えて、新しい分子および細胞生物学のあなたの基本的な知識を維持するために本当の努力を必要とします。 それはちょうど幾つかの分のそれらの基本原則でブラッシュアップすることを可能にする読みやすい記事を見つけることができる場所があった

…私はあなたが”はい”と言ったことを願っています,これは私の目的であるため、”基本:”記事のシリーズ,我々はすでに持っています,そしてしていきます,定期的にあなたにもたらします. この記事では、DNAライゲーションの基本を説明します。,

あなたのDNAライゲーションバディ：DNAリガーゼ

DNAリガーゼ（EC6.5.1.1）は、DNAライゲーション反応の中心にある酵素です。 それは共有結合して鈍いですか多用性がある凝集の端が付いているDNAの隣酸塩骨格を結合します（図1を見て下さい）そしてそれはDNAの分子の二本鎖の壊れ目の修理に自然な役割ですです。 分子生物学では、制限酵素生成DNA断片をベクター骨格に挿入するために一般的に使用されている。 市販のリガーゼには、ATPとMg2+を含む反応緩衝液が供給され、これらは両方ともリガーゼ活性に不可欠である。, ATPは繰り返し凍結融解サイクルによって損傷する可能性があるので、緩衝液のアリコートを作ることをお勧めします（私の記事”5DNA ligation tips”を参照）。

DNAライゲーション反応の二つのステップ

DNAライゲーション反応自体は二つの基本的なステップを持っています。 第一に、DNA末端は偶然に衝突し、リガーゼがそれらに結合するのに十分な長さ一緒に留まらなければならない。 これは反応の最も非効率的な部分であるが、低温ではより容易である。 どうして？, おそらくご存知のように、すべての分子はより高い温度で速く移動するので、二つのDNA末端が低温で溶液中を静かに浮遊している場合、より高い温度 低い温度は、相補的なヌクレオチド間の水素結合を安定させ、実際には物事を所定の位置に保つのに役立ちます。

第二段階は酵素反応であり、図2に概略的に示されている。. DNAリガーゼは3′-OHの5′-リン酸への二段階機構を介して結合を触媒する。 まず、酵素の活性部位のリジン残基に結合しているAMPヌクレオチドを5′-リン酸塩に移す。 その後、AMP-リン酸結合は3′-OHによって攻撃され、共有結合を形成してAMPを放出する。 酵素がさらなる反応を行うことを可能にするためには、酵素の活性部位におけるAMPはATPによって補充されなければならない。,

低温でDNAライゲーションを行うことが役立つ理由はここにあります

DNAリガーゼ酵素は25℃で最適な活性を有するので、ライゲーション反応はDNA末端を一緒にするための最適温度（1℃）と酵素反応（25℃）との間のトレードオフである温度で行われる。 通常、1時間で16℃では問題ありませんが、DNAの端を一緒に持って来ることは、温度を4℃に下げることによってこれを支持する反応の最も効率的な部分であるため、さらに効率を与えることができます。 しかし、この酵素はこの温度で非常にゆっくりと働くので、長い（例えば, 夜間）

もともと31October2007に公開され、5December2014に更新され再公開されました。