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はじめに

次世代シーケンシング（NGS）は、多くの患者の診断、治療の選択、および/または予後に大きな利益をもたらす可能性があるため、haemato-oncologyおよび腫瘍学における臨床環境に急速に拡大している（1）。, 最近、臨床腫瘍学におけるdeep targeted NGSの検証に関するいくつかの記事が出版されました（2、3）、分子病理学会およびアメリカ病理学者の大学（1）による包括的な勧告を含む。 しかし、標的化されたNGS法の標準化の欠如は、依然として臨床診療におけるそれらの実施を制限する（4）。

特に一つの課題は、低変異対立遺伝子頻度（VAF）に存在する突然変異の正確な検出とシーケンシングカバレッジ深さ（1、5、6）の標準化です。, これは、慢性リンパ球性白血病（CLL）におけるTP53遺伝子変異（TP53mut）の場合など、サブクローナル頻度（1）で臨床的影響を及ぼす突然変異にとって特に重要である（7、8）。 TP53異常（TP53mutおよび/または染色体17p欠失）は、CLLにおける治療決定を導く最強の予後および予測マーカーの一つである（9）。, 今日では、慢性リンパ球性白血病（ERIC）に関する欧州研究イニシアチブは、TP53mutを検出限界（LOD）の少なくとも10％VAF（10）で検出することを推奨しており、CLLにおける小さなTP53変異サブクローンの臨床的影響に特化した証拠が増えている（7、8）。

サンガーシーケンシングと深いターゲットNGSは、現在、最もTP53mut分析（10）だけでなく、低対立遺伝子頻度で臨床的影響を有する他の遺伝子の分析のために使用, サンガーシーケンシングは、比較的アクセス可能なシーケンシングアプローチを提供しますが、それは変異した対立遺伝子の10-20％の検出限界のためにサブク NGSベースの解析は、このように体細胞変異の検出のための診断研究所で目立つようになっており、低レベルの遺伝的変異の正確な同定のために、計算および実験の両方の誤り訂正戦略の様々な技術開発が開発されている(11)。, したがって、低VAF変異体だけでなく、自信を持って再現可能な検出を得るために診断NGSにおける配列決定の深さの正しい決定の重要性に対処します。 最後に、我々は我々の理論計算を確認するために希釈実験を行い、我々はCLL患者におけるTP53mutの診断検出と癌診断におけるNGS標準化についてのさらなる,

NGSシーケンシングの深さと誤り率

NGSシーケンシングの深さは、バリアント検出の再現性に直接影響します。整列されたシーケンスの読み取り数が多いほど、ベースコールが参照ベースと同じであるか変異しているかにかかわらず、特定の位置におけるベースコールに対する信頼性が高くなります(1)。 つまり、個々の配列を読み込みエラーの統計的関係のない無により正しく読み込み., したがって、所望のカバレッジ深さは、意図されたLOD、偽陽性または偽陰性の結果に対する許容値、およびシーケンスの誤り率（1、11）に基づいて決定される

二項分布を用いて、与えられた誤り率に対する偽陽性および偽陰性の結果の確率および意図されたLODを計算することができ、与えられた深さを求めるバリアントのしきい値を推定することができる(1)。, 例えば、配列決定誤り率1%、変異対立遺伝子負担10%、およびカバレッジの深さ250リードを考えると、9個以下の変異リードを検出する確率は、二項分布に従って0.01%である。 したがって、10個以上の変異した読み取りを検出する確率は99.99％（100-0.01％）であり、バリアント呼び出しのしきい値を定義することができます。 言い換えれば、カバレッジの深さが250で、しきい値が少なくとも10の変異した読み取りは99です。,99％の確率で、突然変異対立遺伝子負荷の10％が変異体の呼び出しによって逃されることはありません（ただし、異なる割合で検出することができます）。 このようにして、偽陰性の結果のリスクが大幅に最小限に抑えられます。 一方、偽陽性の確率は、シーケンシング誤り率に大きく依存します（すべての解析測定の精度は信号対雑音比に依存するため）（1、11）。 この例では、偽陽性の結果の確率は0.025%ですが、LODを誤り率に近い値まで減少させると、偽陽性の率は無視できません。, 従来の固有ngs誤り率は0.1から1％（phred品質スコア20-30）（1、11）シーケンシングプラットフォーム、ターゲット領域（12）のGC含有量、およびフラグメントの長さに応じて、イルミナペアエンドシーケンシング（13）に示すように範囲します。 したがって、vafs<2%でのバリアントの検出は、カバレッジの深さに関係なく、偽陽性の結果のリスクが高いことによって影響されます。, また、シーケンシングエラー率はシーケンシング自体によって生成されるエラーにのみ適用され、DNA処理およびライブラリー準備中、特に増幅工程中に導入される他のエラーは含まれないことに言及することも重要である(1,11)。

臨床設定における最小シーケンシングカバレッジ

現在、NGSによる深いターゲットリシーケンシングを使用した臨床設定における最小必要なカバレッジについてのコンセンサスはないため、各研究室は十分な品質を満たすために独自のパラメータを設定しなければならない(1,5)。, 現在まで、臨床腫瘍学における深層標的NGSの最小カバレッジ基準を推奨している研究はわずかである:500カバレッジの深さとLODが5%(2)、300-500カバレッジの深さがLODに反することなく(3)、250カバレッジの深さとLODが5%のしきい値調整で1,000カバレッジの深さが低腫瘍細胞性サンプルにおける異種バリアントの場合に必要である(1)、100カバレッジの深さが少なくとも10バリアント読み取りとLODが10%(10)。, バイノミナルデータ分布によると、カバレッジ深さ250は、実際には5%のvafを検出するのに十分であり、読み取りをサポートするバリアントのしきい値≥5で 一方、カバレッジ深さが100のNGS分析と、ERIC consortiumが推奨する読み取りをサポートする少なくとも10バリアントの要件（10）は、45％のlodを持つサンプルでは10％の偽陰, これらの理論的計算を確認するために、我々はTP53NGS分析の性能を推定するために二つの独立した希釈実験を行い、10％のVAFを100読み取りのカバレッジの 確かに、我々は偽陰性の30％（5陽性サンプルの7真陽性サンプルと9陽性サンプルの13真陽性サンプル）二つの独立したシーケンシングランで検出しました。 残念ながら、偽陰性率は、多くの場合、ターゲットの再配列で過小評価されています。, また、15と50％の間のVAFsと体細胞変異体検出の実験室間の結果を調査する最近の研究111研究室で5-15％の報告されたLodを持つ（6）は、診断NGSの主要なエラーが高い突然変異負荷を有するサンプルであっても、偽陰性の結果から生じる可能性があることを示している（6）。 三つの同時偽陽性の結果のうち、すべての変異体が正しく検出されたが、誤って特徴付けられた（6）。, 研究所は、特定されたバリアント（6）以外の地域のカバレッジ深さを報告するように求められていないので、我々は、低いカバレッジまたは高いバリアン これらの結果は更なる信頼を高めることに標準化された複数のパラメータ診断ゲ考慮し、シークエンスのエラーなどのアッセイ特有のエラー。

図1. 二項分布に従ったカバレッジ深さの関数としてのLOD。, 累積確率設定では、意図したLOD(3-20%VAF範囲内)を維持するために必要なカバレッジ深さ:偽陽性確率0.001と真陽性0.999の場合、20%のLODは61カバレッジ深さ、10%のlodは175、5%のlodは562、3%のlodは1,650で達成されます。 偽陽性確率0.010と真陽性0.990の場合、20％のLODは31で、10％のLODは81で、5％のLODは288で、3％のlodは886カバレッジ深さでそれぞれ達成されます。 偽陽性確率が0.050、真陽性が0の場合。,950では、20%のLODが30で、10%のLODが30で、5%のlodが124で、3%のlodが392のカバレッジ深さでそれぞれ達成されます。

診断NGSを介して検出されたCLLにおけるTP53サブクローン変異の頻度

現実世界の設定で低VAFの発生を評価するために、我々は私たちの診断検査室でTP53mutのために調べたCLL患者のコホートを見直しました。 TP53mutは、以前に報告されたように評価した（14、15）。 簡単に言えば、TP53（エクソン2-10 2bpイントロニックオーバーラップ、5’および3’UTRを含む）は、反応あたり100ng gDNAを用いて分析した。, アンプリコンベースのライブラリは、MiSeq（2×151、Illumina）上のペアエンドとして配列され、最小ターゲット読み取り深さは5,000xであり、TP53mutのLODは1％に設定され、1-3％の範囲の変異体は複製によって確認された。 書面によるインフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って登録されたすべての患者から得られ、研究は地元の倫理委員会によって承認された。

859CLL患者（April2016–April2019）の診断コホートのうち、25％（215/859）はTP53mut陽性であり、そのうち52.6％（113/215）は10％以下でVAFを有する変異体を運んだ。, 我々の観察に沿って、最近の研究（8）は、診断時および治療時にCLL患者における63および84％の低負担（サンガー陰性）TP53mutsの存在を報告し、TP53mutsの全生存に対する負の影響を治療時に1％VAFを超えることを確認した（8）。,

サブクローン変異の検出のための診断NGS設定のための電卓

最小適切なカバレッジパラメータの決定と研究室を支援するために、我々は補足ファイルに記載されている二項分布（図2）に基づいて、シンプルでユーザーフレンドリーな理論計算機（ソフトウェア）を提供している。 Rのweb（またはデスクトップ）アプリケーションとスタンドアロンのソースコードは、Githubでアクセスできます：https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit。, この電卓を使用すると、シーケンシング深さの正しいパラメータと、所定のシーケンシング誤り率と意図されたLODに対する対応する最小バリアント読み取り さらに、ユーザーはまた配列の誤り率に試金特定の間違いを単に加え、計算機への入力としてこの全面的な間違いを使用することによって他の間違いを たとえば、TP53変異解析の場合、全体の誤差は-1.16％で計算したため、最小カバレッジ深さ要件を2,000に設定し、最小40読み取りのしきい値を3％VAFに設定しました。,

図2. OLGEN Coverage Limit calculator-正しいシーケンス深さとバリアントの対応する最小数を決定するのに適したシンプルな理論計算機は、診断NGSのために推奨与えられたシーケンス誤り率と意図されたLODのための二項分布に従って読み取ります。 計算されたシーケンシング深さおよび対応するバリアント読み取りの最小数の例は、(A)10%VAFおよび検出確率99.9%および(B)3%VAFおよび検出確率99.9%のバリアントに推奨されます。,

ディスカッション

診断NGSは、癌における体細胞突然変異の評価のための臨床設定で目立つようになっているが、シーケンシングパラメータの標準化が不十分であることは、臨床現場での実装を制限している(1)、主に低対立遺伝子頻度(4)で存在する変異体については、依然として制限されている。 我々は、したがって、正しく低VAF変異体の自信と再現性の検出を得るために診断NGSのシーケンシング深さを決定する技術的な問題に対処しました。, 特に、我々はアカウントにシーケンシング誤り率を取って、低対立遺伝子頻度で変異体の検出の所望の確率のためのカバレッジの最適な深さを決定するために理論的な計算を行った。 さらに，希釈実験を行うことにより，これらの理論計算を確認した。 これらの観察に基づいて、我々は1,650以上のカバレッジの深さをお勧めします(一緒に少なくとも30変異リードのそれぞれのしきい値と)≥3%バリアントを呼び出すために99.9%バリアント検出の確率を達成するために,従来のNGSシーケンシングエラーのみを使用して., 1-3%VAF範囲の変異体は、得られた配列データが高品質である場合（平均Q30>90％）および/または複製または直交法（1、11、16）によって変異体が確 また、シーケンシングエラー率を考慮しながら、正しいシーケンシング深さと対応する最小バリアント読み取り数を解決するためのシンプルでユーザーフレンドリーな理論計算機（ソフトウェア） 私達の簡単な計算機は診断NGSの偽陽性および偽陰性の結果を最小にするのを助けるかもしれません。,

それにもかかわらず、正しい配列決定の深さはまた、アッセイ固有の要因（1）によって影響されます。 りにエラーが出る場合があり多くの時のDNAの加工や、図書館が準備中です。 最も一般的なものは、NGSライブラリの準備中に導入される増幅誤差です（1、12、17）。 他の一般的なエラーの原因は、ライブラリの複雑さ（分析された独立したDNA分子の数）、DNAの品質、および標的領域の複雑さなどに関係しています。 すべての潜在的なアッセイ固有のエラーは、試験設計、方法の検証、および品質管理を通じて対処する必要があります。,

現在、診断NGS（11）における高い誤り率を緩和するために、計算および実験の両方の新興の誤り訂正戦略が開発されている。 これまでのところ、最も有望なエラー補正方法の中には、PCRエラーを修正するUMI（Unique Molecular Identifiers）（18）、および信号対雑音補正アプローチ（11）があります。 これらの進歩はLODを減らすことを試み、それによってNGSの診断の未来の機会のために必要とされる配列の正確さを高,

診断NGSの標準化を改善するために、特定のNGSアッセイを取り巻く閾値を評価する際に、正しいカバレッジ深さの推定が推奨される出発点である。 それにもかかわらず、ngsにおける最小技術的要件およびその報告に関する公表されたガイダンスの欠如、特に癌診断におけるクローンおよびサブクローン変異の検出において重要である, これは主に、ライブラリー準備アプローチの広い範囲、および標準化が困難な各特定のNGSアッセイで役割を果たしている多数の変数と、実験室間の変動性によるものです。 したがって、最小技術的要件の定義とNGSにおけるその報告は非常に望ましい。, Haemato-oncologyにおける診断NGSにおける経験に基づいて、lod、NGSアッセイの全体的なエラー（または少なくともシーケンシングエラー率）、DNA入力量、ソース、およびDNAの品質、最小カバレッジ深さとこの最小深さで配列決定された標的塩基の割合、バリアント領域をカバーするターゲットリードの総数およびバリアントをサポートするリードの数を報告することをお勧めします。 ホルマリン固定パラフィン埋め込み（FFPE）サンプル（19、20）のNGS標準化に特別な重点を与えられるべきである。,

一緒に取られて、我々の研究は、正しいシーケンシングの深さと診断NGSにおける低VAFと変異体の信頼性と再現性の検出に必要な読み取りの最小数の重 私たちのユーザーフレンドリーな理論計算機（ソフトウェア）を使用して、与えられた誤り率のための正しいシーケンシング深さの計算は、とりわけサブクローン変異に関連する状況で、診断NGSにおける偽陽性および偽陰性の結果, 診断NGSのための厳密なテストそして標準化された最低条件は臨床設定の正しい結果を保障して特に望ましい。

データの可用性

この研究のために生成されたデータセットは、対応する著者への合理的な要求に応じて利用可能である。

著者の貢献

APとEKは研究を設計し、結果を解釈し、原稿を書いた。 ＡＰ、ＬＳ、ＴＤ、およびＰＳはＮＧＳ解析を行った。 ＴＰは患者サンプルおよび臨床データを収集した。 MVはバイオインフォマティクス解析を行い、電卓コードを書いた。 TN準備webアプリケーション。, すべての著者は原稿の最終版を読み、承認しました。

資金調達

助成金サポート：MZ CR VES16-32339A、部分的にはMH CZ—DRO（FNOl、00098892）によって。

利益相反声明

著者らは、この研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または財務的関係がない場合に行われたと宣言している。

謝辞

私たちは、その記事の参照制限のために引用することができなかった多くの著者にお詫び申し上げます。,

Supplementary Material