Good Mood

結果と議論

シロイヌナズナcDNAライブラリーは、35s標識CaM結合スクリーニングアプローチを用いてスクリーニングした（24）。 陽性クローンの一つは、データベース内のAtCat3と同一のヌクレオチド配列を示した（GenBank accession no. U43147）。 AtCat3がCaM結合タンパク質をコードしていることを証明するために、AtCat3の完全なコード領域はpET14b発現ベクターにサブクローニングされました。 組換えAtCat3は、イソプロピルβ-d-チオガラクトシド(IPTG)によって誘導された(Fig., 1A)をCaMアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、ほぼ均質性にした。 全細菌抽出物をCaM結合アッセイに使用し、35S標識CaMがAtCat3タンパク質にCa2+の存在下で結合することが示された（Fig. 1A）。 ＥＧＴＡを添加した後、Ｃａｍ結合は観察されなかった。 さらに、35s標識されたCaMは、CaCl2がMgCl2またはMnCl2のような他の二価の陽イオンによって置き換えられたときにAtCat3に結合しなかった（図。 1A)、AtCat3へのCaM結合がCa2+依存性であることを示唆している。

AtCat3におけるCaM結合領域を識別するために、二つのC末端欠失変異体は、35S-CaM結合アッセイのために使用されました。 0の存在下で。,2mM Ca2+、CaMは野生型および変異体1-451に結合するのに対し、CaMは変異体1-414に結合しなかった（Fig. 1B)、AtCat3のCaM結合領域がアミノ酸415-451に制限されていることを示唆している。 さらにAtcat3へのCaM結合を確認するために、AtCat3のアミノ酸415-451に対応する合成ペプチドをCaMとインキュベートした。 ペプチド-Ｃａｍ複合体の形成を非変性ＰＡＧＥにより評価した。 36-merペプチドは、Ca2+の存在下でCaMと安定な複合体を形成することができる（Fig. 第1回）を開催した。 ペプチドの非存在下では，単一のＣａｍバンドが観察された。, ペプチド濃度が増加するにつれて，ペプチド-Ｃａｍ複合体を表す低移動度の別のバンドが現れた。 ペプチドとCaMの間のモル比が1:1であったとき、ペプチド-CaM複合体バンドのみが検出され、ペプチド中に一つのCaM結合部位のみが存在することを示 ＥＧＴＡの存在下ではペプチド-Ｃａｍ複合体は形成されなかった（Fig. 第1回）を開催した。 これらの結果は、CaMがカルシウム依存的にAtCat3に特異的に結合することを示している。

カタラーゼはほぼすべての好気性生物に存在する。 動物では、単一の遺伝子によってコードされる唯一のカタラーゼアイソフォームがあります。, 対照的に、植物中のカタラーゼは、小さな遺伝子ファミリー（によってコードされた複数のアイソフォームとして存在する6、26）。 少なくともこれはカタラーゼがよく特徴付けられるタバコ、シロイヌナズナおよびカボチャのようなトウモロコシおよび双子葉植物のような単子葉植物で本当です。 興味深いことに、それぞれ三つのアイソフォームで符号化される遺伝子です。 すべてのカタラーゼがCaM結合領域を有するかどうかを決定するために、細菌、動物、および植物由来の37カタラーゼのアミノ酸配列をGCG10パッケージのpileupプログラムを用いて比較した。, アミノ酸配列比較は、N末端384aa（約60％の類似性および50％の同一性）における非常に高い相同性を明らかにした。 しかし、CaM結合領域が位置するC末端108aaでは、AtCat3と他の非植物性カタラーゼ（約21％の相同性および14％の同一性）との間にほとんど類似性がなかった。 それにもかかわらず、すべての植物カタラーゼは、特にAtCat3のCaM結合領域に対応する領域で、この部分（約78％の相同性と70％のアイデンティティ）で高い相同性 イチジク。 図2に、代表的なカタラーゼ108-aa13個のc末端の配列比較を示す。, 特徴付けられたCaM結合タンパク質のアミノ酸配列はCaM結合領域で保存されていないが、それらのほとんどは、二次構造的な特徴、基本的な両親媒性α-ヘリックス（27）、オーキシン調節タンパク質ZmSAUR1（24）および植物キメラCa2+/CaMプロテインキナーゼ（28）などを有する。 CaM結合領域には負に帯電したアミノ酸がしばしば存在するが、正味電荷は正であることに注意してください（16）。 GCGプログラムを用いたヘリカルホイール投影に基づいて、AtCat3のアミノ酸438-451は塩基性の両親媒性α-ヘリックスを形成することができることが決定さ, ヘリカルホイールの一方の側は疎水性であり、他方の側は正味の正電荷で親水性であることは明らかである。 AtCat3のCaM結合領域に対応するアミノ酸配列の分析は、他の植物カタラーゼのいくつかにおける塩基性両親媒性α-ヘリックスの存在を予測した。 興味深いことに、トウモロコシ、タバコ、シロイヌナズナ、カボチャの三つのカタラーゼアイソフォームのうち、各種両親媒性α-ヘリックス構造を持つ少なくとも一つのアイソフォームがある。,、tobacco1（アミノ酸431-444）、maize3（アミノ酸442-455）、およびpumpkin1（アミノ酸438-451）、ならびにシロイヌナズナAtCat1（アミノ酸438-451）。 それがすべての植物種に当てはまるかどうかは、GenBankの他の植物種のカタラーゼ配列が限られているため、明確ではありません。 細菌および哺乳類のカタラーゼの結晶構造データに基づいて、αヘリックスはこれらのカタラーゼ（29）のC末端部分の典型的な構造であるが、ヘリックスホイール投影によると、この部分には基本的な両親媒性αヘリックス構造は存在しない。,

CaMがplantaから精製されたカタラーゼに結合するかどうかを試験するために、DurnerおよびKlessig（10）に基づいて葉からタバコカタラーゼを精製した。 精製プロセスの最後のステップとしてＣａｍ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用した。 1,000gのタバコ葉を用いたカタラーゼの精製工程の概要を表1に示す。 タバコカタラーゼをＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび銀染色により判定して均質性に近いまで精製した（Fig. 3、レーン1）。 カタラーゼの同一性は、タバコカタラーゼに対するｍａｂによるウェスタンブロッティングによって確認され 3、レーン3）。, 精製タバコカタラーゼへのｃａｍ結合は以下のアプローチにより実証された。 （ｉ）タバコカタラーゼの精製にＣａｍ-セファロースカラムを用いた。 このステップの回収率は81％であり（表1）、タバコの葉からのカタラーゼのほとんどがCaM結合タンパク質であることを示唆している。 (ii)35S標識CaMを用いて、0.2mM CaCl2の存在下で精製されたカタラーゼへの結合を試験した（Fig. 3、レーン5）。 組換えAtCat3を対照として使用した（Fig. レーン3、レーン2、レーン4、およびレーン6）。 0の追加。,4ミリメートルEGTAは、CaMがCa2+依存的に植物カタラーゼに結合することを示唆し、CaM結合を廃止した。 Ｃａｍ結合アッセイはまた、それが真菌、ウシ、またはヒトカタラーゼに結合するかどうかを決定するために行われた。 結果は、これらの非植物性カタラーゼのいずれもＣａｍ結合を示さず（データは示さず）、これはアミノ酸配列比較と一致することを明らかにした（Fig. 2)., 表1

タバコの葉からのカタラーゼの精製

他の特徴付けられたCaM結合タンパク質におけるCaM結合部位または密接に並置された領域は、しばしば自己阻害または偽基質ドメインとして機能する。 この領域は、植物キメラCa2+/CaM依存性プロテインキナーゼ（30）およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（31）のようなCa2+シグナルの非存在下で不活性状態で標 植物カタラーゼへのCaM結合の意義を研究するために、組換えAtCat3と精製タバコカタラーゼの触媒活性は、CaCl2とCaMの存在下および非存在下で測定した。, 同様の実験は、他の非植物性カタラーゼを用いても行った。 大腸菌で発現した組換えAtCat3は活性を示さなかった。 別の研究室でも同様の結果が得られた（Zhixiang Chen、personal communication）。 アクティブカタラーゼは四つの同一または類似のサブユニット（6、10、26）からなる四量体であるため、これは、組換えカタラーゼのための正しい構造を形成するために失敗したことに起因している可能性があります。 対照的に、精製されたタバコカタラーゼは、精製工程中に活性の有意なCa2+/CaM依存性変化を示した（表1）。, Ca2+/CaMの刺激効果は、CaM-セファロースクロマトグラフィーの後に得られたサンプルを除いて、各ステップで約2.2倍である。 これは、おそらく非Ca2+/CaM結合カタラーゼ画分の除去のためにカタラーゼ活性（2.5倍）の高い刺激を示した（表1）。 非Ca2+/CaM結合カタラーゼ画分は59.6単位（基礎活性）の比活性を有していた。 しかしながら、Ca2+/CaMは、このカタラーゼ画分の活性を刺激しなかった（データは示さない）。, これらの結果は、Ca2+/CaMは、CaM結合の結果に対応するCaM-セファロースクロマトグラフィーの後に得られた画分中のタバコカタラーゼを活性化することがで 異なる種からのカタラーゼの比活性に有意差があるため、異なるソースからのカタラーゼの活性に対するCa2+/CaMの効果を比較するために、相対活性を使用 例えば、A.ニジェールカタラーゼは5.7単位、ウシ肝臓カタラーゼ51.9単位、ヒト赤血球39.5単位、タバコカタラーゼ63単位の比活性を有する。,1単位（Ca2+/CaMの非存在下で）。 イチジク。 4Aは、CaCl2単独またはCaM単独では、タバコカタラーゼ活性（最大活性の約40％）に刺激効果を有さなかったことを示している。 Ca2+、CaM、およびCa2+/CaMの存在下または非存在下では、真菌、ウシ、またはヒトカタラーゼにおいて触媒活性に差は観察されなかった（Fig. 4A）。 CaCl2をMgCl2に置き換えることにより、CaMの存在下または非存在下ではタバコカタラーゼ活性に有意な変化はなかった（データは示さない）。, 植物カタラーゼ活性に対するCa2+/CaMの効果をさらに文書化するために、10μmのAtCat3CaM結合領域（415-451）に対応するペプチドを各反応混mixtureに添加した。 非植物性カタラーゼはペプチドの添加によって影響を受けなかった。 しかし、タバコカタラーゼ活性に対するCa2+/CaMの刺激効果は、ペプチドの添加によって廃止された（図。 4A）。 さらに、タバコカタラーゼ活性に対するペプチドの阻害効果は、ペプチドの濃度に依存した（図。 4B）。, カタラーゼ活性は、カタラーゼの基礎活性に近い約58％阻害された。 しかしながら、このペプチドは、試験した全ての濃度でウシカタラーゼ活性に影響を及ぼさなかった（Fig. 4A）。 これらの結果は、Ca2+/CaMは、精製された植物カタラーゼに刺激効果を有するが、非植物カタラーゼには影響を及ぼさないことを示唆している。

カタラーゼは優勢なペルオキシソーム酵素であるが、ミトコンドリアおよび細胞質にも存在することが知られている（32）。 例えば、アミノ酸配列比較に基づいてCaM結合カタラーゼである可能性があるトウモロコシCat3は、ミトコンドリアタンパク質である（33）。 結果は以下の通りである。 1-4)CaMが植物カタラーゼに結合し、その活性を調節することを示す。 生体内でこの調節活性の存在を実証するために、我々はCaMが植物のペルオキシソームにおけるカタラーゼと共存するかどうかを検討した。, 黄化カボチャ子葉抽出物からのオルガネラをしょ糖密度遠心分離により分離した。 溶液中に存在するか、単にペルオキシソーム膜に関連付けられているかもしれない細胞質タンパク質の汚染を除去するために、単離されたペルオキシソームは、プロテイナーゼKで処理された。このようにして、ペルオキシソーム膜によってプロテアーゼからシールドされたペルオキシソームタンパク質は消化されなかった（34、35）。 ペルオキシソーム画分の同一性は、カタラーゼ活性（測定することによって証明された35）。, CaMは非常に王国（13-16）全体で保存されているので、我々は抗ヒトCaM抗体を用いた西洋分析を行った。 対照として、組換えジャガイモカムPCM6を用いた（Fig. 5、レーン3）。 興味深いことに、PCM6に類似したサイズのバンドがペルオキシソーム画分に存在していたが、強度はサイトゾルCaMと比較してかなり低かった（Fig. 5). これらの結果は，Ｃａｍとカタラーゼがペルオキシソーム中に共局在していることを示した。 CaMは、主に細胞質で発現される小さな酸性タンパク質である。, しかし、植物において、CaMは、核および葉緑体（36、37）および細胞外マトリックス（38）などのいくつかの細胞小器官に存在することが示されている。 また、CaM調節タンパク質は、細胞外マトリックス、核、および葉緑体（38-40）に存在する。 どのようCaMを横切る膜であるかは不明である。 最近の研究は、翻訳後修飾は、いくつかのCaMアイソフォームの転座に役割を果たしていることを示しています。 例えば、ペチュニアCaM様タンパク質、CaM53は、タンパク質がプレニル化されるときに原形質膜と関連している。 プレニル化が阻害されると、CaM53は主に核に見出される（41）。,

私たちの知る限り、ペルオキシソーム中のカルシウム濃度について議論する報告はありません。, ペルオキシソーム生物発生の最近の修正モデルに基づいて、ペルオキシソームは、プレペルオキシソーム小胞（42）によって小胞体（ER）に由来する。 ＥＲは細胞内カルシウムプールの一つであることが知られている。 従って，ペルオキシソーム中のカルシウム濃度はＥＲと同じくらい高いことが分かった。 ペルオキシソームカルシウム濃度を測定し、細胞質とペルオキシソームにおけるカルシウム濃度の変化との間のリンクを監視することは、ペルオキシソームカタラーゼがCa2+/CaMによって調節される方法の理解に役立つはずである。, 例えば、遊離カルシウム濃度は、ペルオキシソーム標的化シグナルを有する再構成エクオリンを用いてトランスジェニック植物において測定することができる。 エクオリンはカルシウム感受性の発光タンパク質であり、その発光はカルシウムの変化を直接報告する（43）。 ペルオキシソームは有毒なROS、主にH2O2を除去する主要なオルガネラであるため、ペルオキシソームカタラーゼ活性はH2O2をin situで急速に分解するためにすべての時間が高いままであると推測することは合理的である。 しかし，サイトゾルカルシウムの変動はサイトゾルカタラーゼ活性に大きな影響を及ぼす可能性があった。, すべてのカタラーゼがCaM結合タンパク質ではないことを強調することが重要です。 したがって、さらなる調査は、異なる細胞小器官におけるカタラーゼ活性を制御する上でCa2+/CaMの重要性に対処するために必要とされる。

生物および非生物的ストレスはCa2+流入を引き起こし、増加した細胞質Ca2+はH2O2の産生を刺激し、メッセンジャーとして周囲の細胞に拡散し、生理学的応答を誘導する（19、20）。 我々の結果は、増加した細胞質Ca2+は、カタラーゼ活性のCa2+/CaM媒介刺激によってH2O2レベルを減少させることができることを示唆している（図。 4)., 我々は、増加したサイトゾルCa2+H2O2恒常性を調節する二重の役割を持っていることを提案する（図。 6):(i)正の調節は、直接CA2+(22)に親和性を有するNADPHオキシダーゼを活性化し、Ca2+/CaM調節NADキナーゼ(23)によって間接的により多くのNADPHを産生することによってH2O2を生成し、(ii)負の調節は、CA2+/CaM変調を介してカタラーゼ活性を刺激することによってH2O2を減少させる(Fig. 4)., Ca2+トランジェントにおける信号誘起変化は、周波数、持続時間、振幅、および振動の空間的局在、およびカルシウム標的タンパク質（12、44）に差動効果につながる空間伝搬のモードで異なる場合があります。