結果
未処理のサンプル。 特に、未染色試料であっても、水と油の液滴の違いが観察されている（Fig. 図1BおよびC)または細胞の異なる構成成分の間で（図。 1D)を十分なコントラストを識別します。 細胞では、異なる領域に濃縮され得る塩、蛍光体、および鉄などのより高い-Ｚ材料は、コントラストを改善する傾向がある。 イチジク。, 1Dは、室温で正常培地中の未処理のチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を示しています。 細胞の輪郭およびその内部構造を有する核は、細胞質における一連の暗い球状粒子と同様に、はっきりと見える。 脂質滴としてのこれらの粒子の同定は、以下で論じられる。
重金属染色。 低Z材料を観察するときの解像度とコントラストの限界は、電子密度の高い汚れやナノ粒子の金ラベルなどの高Zマーカーで細胞を染色することによってかなりの利点を達成できることを示唆している。, 実際、我々は、極薄膜を使用することによって、水中の金ビーズを直径10nmまで検出することができる（データは示さない）。
電子材料を用いた細胞内のオルガネラの差動染色は、通常SEMには適用されないが、EM技術の標準である。 イチジク。 図2は、培養細胞の内部において、仕切り膜上に直接成長させた後、酢酸ウラニルで固定して染色した構造の豊富な多様性を示している(8)。 細胞内オルガネラは、ミトコンドリアの内部詳細を含めてはっきりと見える（Fig。 2C)、アクチンストレスファイバー(Fig., 2D）、および複雑な管状および細胞骨格構造（Fig. 2AおよびB）。 の高いビームエネルギーを示す。 2Cは内部構造をプローブするが、より低いエネルギーでは 2D)、膜に近い表面が可視化される。 このように、異なるエネルギーを利用できる三次元情報です。
染色細胞のイメージング。 アスタリスクは核を示し、細い矢印はミトコンドリアを示します。 （A）HeLa細胞は、通常の成長培地中で膜上に成長し、その後、パラホルムアルデヒドで固定し、酢酸ウラニル（12kVでイメージング）で染色した。, (B)A.に示すマークされた長方形の倍率(C)CHOセルは、グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドで固定し、酢酸ウラニルで染色し、水中に維持(30kVで撮像)。 太い矢印は、脂質滴を取り囲むミトコンドリアを示します。 （はめ込み）ミトコンドリア（細い矢印）を示すより高い倍率。 （Ｄ）染色されたＣＨＯ細胞におけるアクチン繊維。 治療および画像化は、Ａについて記載されている通りである。
ナノ粒子金マーカー。 検出のresolution解能および特異性は、抗体または他のリガンドの結合によって達成することができる。, 他のEM法と同様に、標識は金ナノ粒子を使用することによって最も便利に行われる。 非常に薄く、しばしば任意のセクションのみをサンプリングする透過EM（TEM）とは対照的に、湿式SEMは、セル全体のラベリングのローカルビューとグローバルビュー イチジク。 3AおよびBは、40nmのナノ粒子金標識モノクローナル抗表皮成長因子受容体抗体が無傷のA431癌細胞に表皮成長因子受容体を標識するために使用, 固定はしばしば湿式ＳＥＭにおいても有用で便利であり，顕微鏡への移動と同様に標識を容易にすることができる。 ここに示される細胞はまた、標識された受容体を細胞の一般的な構造と整列させることができる酢酸ウラニルで染色される。 ナノ粒子の高いコントラストと均一なサイズは、明確な同定と局在化を可能にする。 単一の受容体分子の正確な局在を知ることは、表皮成長因子誘発受容体二量化などのイベントを測定する可能性を開きます。, 標識には細胞の染色は不要であり、染色されていない標識細胞の画像を含んでいる（Fig. 7、PNASのウェブサイト上のサポート情報として公開されています）。 また、セルの内部部分のマーキングが可能であることを示す画像も示されている（図。 8、PNASのウェブサイト上のサポート情報として公開されている）、この場合、金のビーズでミトコンドリアのマーキング。 細胞内部のアクチンフィラメントの標識は、サブナノメーター金粒子、続いて銀増強（データは示さない）を使用することによっても達成されている。
細胞上のナノ粒子金マーカーのイメージング。 矢じりは金ナノ粒子を示す。 （A）表皮成長因子受容体は、40nmの金ナノ粒子a431細胞で免疫標識し、酢酸ウラニル（30kVでイメージング）で対比染色した。 (B)E.に示されているマークされた長方形の倍率(C)H.ピロリ菌上の推定ガストリン受容体,ストレプトアビジンコーティングされた20nmの金粒子上のcomplexedビオチン化ガストリンとインキュベーション後,ポリ(l-リジン)コーティングされた膜上にグルタルアルデヒドと沈降が続く(20kVでイメージング).,
細菌に対する金ラベリングの例を図に示す。 3． ここでは、ヘリコバクター-ピロリ（9）の推定ガストリン受容体は、ビオチン化ガストリンとストレプトアビジンコーティングされた20nmの金ナノ粒子の複合体とのインキュベーションによって検出される。 ストレプトアビジンコーティングされた金の前にビオチン化ガストリンを投与すると，細菌へのナノ粒子の付着はほとんどなかった。 この結果は二つのステップ間の時間とは無関係に得られ，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉへのガストリンの取り込みはほぼ即時であることを示唆した。, 複合体ガストリンが細胞に入らなかったという事実は、細菌によって内在化することができる粒子のサイズの限界を定義する可能性を指す。
イメージング技術の比較（Trypanosoma brucei）。 この技術を単一モデルシステムを用いた既存のイメージング技術と比較することは有用である。 このような研究は、図に詳述されている。 4、tsetseのはえのmidgutで広がる寄生虫T.bruceiのprocyclic形態を使用して。 最初の三つの画像は、イメージングの既存のモードを表示します：光学蛍光顕微鏡（Fig., 4A)、差分干渉コントラスト顕微鏡(Fig. 図4B)、およびTEM(Fig. 4C）。 既存の技術の強さは明白である:蛍光性の集中させた印およびTEMの詳しいセクション。 この未処理の光学（Fig. 図4B)およびwet-SEM(Fig. 4D）画像は、セルの境界を描くが、コントラストが低く、詳細が不足しています。 いずれも核を強調するが，差分干渉コントラスト像に現れる他のオルガネラは明確に同定されなかったが，湿式-ＳＥＭ像は脂質滴を有利に引き出す。 四酸化オスミウム染色（Fig., 4E）は、主に脂質滴といくつかの正体不明の内部オルガネラを強調し、このシステムではそれほど有用ではありません。 最も強いイメージ投射は図で見られます。 酢酸ウラニル染色を用いた4F。 完全な細胞を見ることができるインタクトイメージングの利点（詳細に観察することができるその微細な内部構造とともに）は、特にTEMイメージングと比 4C）。 最後に、主要なグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー表面コートタンパク質EPプロサイクリン（10）に対する抗体による全細胞特theなマーキングのwet-SEMイメージングは、図に示されている。, 4GおよびH. 興味深いことに、EP procyclinは、全ての細胞に均一にも観察された信号のペアをクラスタリングしました。 我々はこれを、ホルムアルデヒド中の固定が防ぐことができないプロセスである抗体の影響下でクラスターに基づく脂質ラフトの傾向に起因すると考えている。 金のマーカーはまた、標準的なSEMができる画像を連想させる方法で細胞の三次元配座を解明する（T.bruceiの優れた、代表的なSEM画像はhttp://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.htmlで見つけることができる）。
T.bruceiのマルチモーダルイメージング。, セルの典型的な長さは、長さが20μm、幅が3μmである。 （A）共焦点蛍光顕微鏡。 抗ＥＰプロサイクリン抗体（シダーリン）を用い，フルオレセインイソチオシアネート（グリーン）に結合した抗マウスで結合を検出した。 核およびキネトプラストの染色はヨウ化プロピジウム（赤色）で行った。 （B）光学（差動干渉コントラスト）イメージング。 （Ｃ）細胞のＴＥＭ切片、続いて酢酸ウラニル染色、内部オルガネラを明らかにする。 （Ｄ）水和された非染色細胞全体の湿式-ＳＥＭイメージング。 （Ｅ）四酸化オスミウム染色を用いたＤについて記載されているように。, （Ｆ）酢酸ウラニル染色を用いたＤについて記載したように。 （Ｇ）抗マウス抗体に結合したナノ粒子金マーカーは、表面ＥＰプロサイクリンタンパク質の位置を示し、同時に三次元図を可能にする。 （Ｈ）Ｇに示す細胞の中央部の高倍率、細胞内の三次元ヘリシティの領域を明らかにする。明らかに、TEMは一般的に湿式SEMよりも優れた解像度を有するが、比較のためにT.bruceiの例で提示された画像は、同じ実験室で得られた”典型的な”画像である。, 湿式ＳＥＭはＴＥＭおよび光学顕微鏡とは有用性が異なるため，Ｔ．ｂｒｕｃｅｉでは重要な補完的能力と見ることができ，光学，ＴＥＭおよび湿式ＳＥＭ技術の組み合わせによって全体像が与えられることが期待できる。
組織切片。 湿式SEMは、組織断片などの厚い試料に対して、試料を膜に対して取り付けるだけで使用できます。 BSEsの限られた見本抽出の深さは薄い区分のための必要性なしで少数のマイクロメートルまでの定義された深さに表面から伸びる”事実上セクションの,
図。 図5AおよびBは、マウスからの未治療の組織の直接可視化を示す。 イチジク。 5Aは心臓組織の小倍率画像である。 筋肉細胞の組織は明らかである。 一つのセルにズームする（Fig. 5B）は、核および細胞内オルガネラ、おそらくミトコンドリア、および細胞内でのそれらの分散の鮮やかなビューを提供します。 培養細胞について上記に示したように、組織の染色は有利であるが必須ではなく、多くの特徴の視覚化を強化することができる。 イチジク。 図5CおよびDは、ラットの腎皮質の領域を示す。, 染色（フェリシアン化カリウム）は、腎尿細管の上皮内の全体的な組織および細胞の接触を強調する。 染色およびイメージング条件の注意深い調整は、組織構造などの異なる補完的な情報を明らかにすることができる；例えば、酢酸ウラニルで染色された
組織のイメージング。 （A）マウス心臓、未処理、30kVでサンプルホルダーに直接画像化。 （Ｂ）Ａに示す矩形のより高い倍率, (C)ラット腎臓を解剖し、切断し、ホルマリンで24時間固定した後、組織を0.1％酢酸ウラニルで10分間染色した。 ＣおよびＤは、髄質線の尿細管の内側表面内に上皮細胞を示す。 膜を支える格子はこの映像で目に見える。 （D）Cに示されているボックスの倍率
同時光子収集（CL）。 湿式ＳＥＭにおけるＢＳＥ検出は、光子の同時収集によって補完することができる。, 走査型電子ビームは試料中の分子を励起し、その後、特性波長（ＣＬ）で光を放出することができる。 次いで、光強度を使用して、細胞に内因性または外部に導入することができる標識のいずれかであるシンチレーション分子の分布の画像を導出する。 この画像は、光回折ではなく、電子–物質相互作用によって制限された分解能でBSEによる画像と同時に得られる(6)。 サンプルの下の流体にライトガイドを挿入し、放出された光を光電子増倍管に導きました。, このセットアップは，同時ＢＳＥ検出の効率を損なうことなく，電子ビームによって励起された光子の良好な結合と効率的な収集を達成する。
図。 図6は、bseと光子によって同時に可視化された未処理のCHO細胞を示しています。 である。 図6Aに示すように、細胞の境界は電子イメージングモードで明確に概説されており、核（核小体とともに）が顕著であり、核の周りの暗い≤1μmのスポット これらは、我々が調査したすべての真核細胞の細胞質に現れ、その数は変化するが、通常は核の周りに分散している。, 図に示すＣＬ画像である。 図6Bに示すように、細胞の輪郭および核は明確に定義されており、細胞内のシンチレーション分子（自家蛍光に似ている）の分布を示している。 このモードでは、同じスポットが光子の高い放出によって特徴付けられる。 高陰極ルミネセンスシグナルと高炭素content有量の組み合わせは、細胞のエネルギー貯蔵に関与する脂質滴（11）の典型的なものである（12）。, 200μmのオレイン酸を添加する独立した試験は、観察された斑点が脂質滴であるという概念と一致して、細胞内でこれらの液滴の強い増殖を引き起こした（データは示されていない）。
後方散乱光子と電子ビーム励起光子（CL）との同時イメージング。 （Ａ）非染色ＣＨＯ細胞は、図に記載されているようにＢｓｅｓを用いて撮像される。 1日目— （Ｂ）Ａに示すものと同時に撮影された出射光画像。,湿式ＳＥＭは、脂質の保存において、特に脂質滴のような大きな凝集体において、標準的なＳＥＭ技術よりも利点を有する。 乾燥のための必要性を除去することはそれらを分解するかもしれない有機溶剤から脂質を救う。 オスミウム処理はいくつかの脂質二重層を保存するが、より大きな凝集体では、オスミウムはすぐに反応してオスミウムを入れない外部の地殻を作り出し、凝集体はその後のorganic媒処理に対して脆弱である。, 極低温製剤では、脂質–水境界に沿って亀裂が生じる開裂プロセスの傾向もまた、大きな脂質構造にとって危険である。
マーカーの高解像度イメージングは、細胞内の特定の分子のためのラベルの開発を必要とする、CL検出モードの非常に望ましい機能です。 である。 9、PNASのウェブサイト上のサポート情報として公開されている、我々は、直径0.2μmの標準的な蛍光ビーズは、電子ビームの下で激しく光子を放出し、≥100nm（7）の分解能でイメージングすることができることを示している。, 小さなビーズのイメージングは低輝度によって制限され、小さな直径での特殊なシンチレーションビーズの開発を伴う。 ビームがビーズに直接衝突しているときにシンチレーションの励起機構が最も強いので、我々はこれが光学顕微鏡で利用可能なものを超えて一桁蛍光イメージングの分解能を拡張することができることを期待しています。
