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소개

차세대 시퀀싱(NGS)가 급속도로 확장하는 임상 조정에 haemato-종양학과,종양학 그것이 가져올 수 있습니다 중대한 이득을 위한 진단,치료의 선택,그리고/또는 불확실성을 만드는 많은 환자는(1)., 최근,여러 기사에 대한 검증의 대상으로 깊은 NGS 임상에서 종양학 출판되었다(2,3)포함한 포괄적 추천에 의해 연결에 대한 분자병리과대학의 병리학자는(1). 그러나,표적 NGS 방법의 표준화의 부족은 여전히 임상 실습에서의 구현을 제한한다(4).

중 하나에 도전에 특정 정확한 탐지의 돌연변이 낮은 변종 대립 주파수(느리게 실행으로 평소와 같이 정상)와의 표준화 시퀀싱 범위를 깊이(1,5,6)., 이를 위해 특히 중요 돌연변이 있는 임상 영향에 subclonal 주파수(1)같은 경우 TP53 유전자 돌연변이(TP53mut)에서 만성 림프성 백혈병(CLL)(7,8). TP53 수차(TP53mut 및/또는 염색체 17p 삭제)는 CLL(9)에서 치료 결정을 안내하는 가장 강력한 예후 및 예측 마커 중 하나입니다., 요즘에는 유럽 연구 주도권에서 만성 림프성 백혈병(에릭)을 권장 검 TP53mut 의 한계와 detection(LOD)의 10%이상 느리게 실행으로 평소와 같이 정상(10 분),그리고 성장하는 몸의 증거는 존재 하에 전념하는 임상의 영향을 소 TP53 돌연변이 subclones CLL(7,8).

생어 시퀀싱고 깊은 대상으로 설정은 현재의 기술을 가장 많이 사용에 대한 TP53mut 분석(10)뿐만 아니라 분석을 위한 다른 유전자의 임상에 영향을 저렴한 대립 주파수., 지만 생어 시퀀싱을 제공한 상대적으로 액세스할 수 있는 시퀀싱 접근 방식이 부족하는 감도를 감지하는 데 필요한 subclones 해 검출한계 10~20%의 돌연변이 대립(10). NGS-기반으로 분석을 따라서 명성을 얻었 진단 실험실의 탐지를 위한 신체의 변형과 다양한 기술 개발의 오류 수정 전략을 모두 계산 및 실험,개발되고 있는 대한의 정확한 식별 낮은 수준의 유전자 변형을(11)., 따라서 우리는 주소의 중요성의 정확한 측정 시퀀싱 깊이에서 진단 NGS 을 얻기 위해서 자신감 및 재현 가능한 감지,하지만 낮은 느리게 실행으로 평소와 같이 정상 변형이 있습니다. 마지막으로,우리는 우리가 수행,희석 실험을 확인 우리의 이론적 계산,그리고 우리는 근접에 의해 논의는 우리의 경험을 가진 진단의 탐지 TP53mut 에 CLL 환자를 추가한 관점에 대해 깊이의 표준화를 암 진단을 수행합니다.,

NGS 시퀀싱 깊이와 오류 평가

NGS 시퀀싱 깊이있는 직접 영향을 미치의 재현성을 변형을 검색:더 높은 수의 정렬 순서를 읽고,더 높은 자신감을 기본화에 특별한 위치는지 여부에 관계없이 기본화가 동일한 기준으로 기본이나 돌연변이(1). 즉,개별 시퀀싱 오류 읽기는 올바른 읽기에 의해 수적으로 열세 일 때 통계적으로 관련이 없습니다., 따라서,원하는 범위 깊이 있어야에 따라 결정된 것입 LOD,관용에 대한 거짓 긍정적 또는 부정적인 결과를 거짓이며,오류가 평가의 시퀀싱(1,11).

를 사용하여항 분포,확률 긍정 오류 및 부정적인 결과를 위해 주어진 오류 평가뿐만 아니라용 LOD 계산할 수 있습 및 임계값을 변화된 깊이를 추정할 수 있습니다(1)., 예를 들어,주어진 시퀀싱 오류 1%의 비율,돌연변이 대립유전자의 부담을 10%,과 깊이의 범위 250 읽지 9 적은 변화를 읽고 이에 따라,항 분포,0.01%. 따라서 감지할 확률이 10 개 이상의 변형을 읽은 99.99%(100-0.01%),및 임계값을 변화를 정의할 수 있습니다. 다시 말해,적어도 10 개의 돌연변이 된 읽기의 임계 값을 갖는 250 의 커버리지 깊이는 99 를 가질 것이다.,돌연변이 대립 유전자 부하의 10%가 변형 호출에 의해 누락되지 않을 것이라는 99%의 확률(다른 비율로 검출 될 수 있지만). 이러한 방식으로 거짓 부정적인 결과의 위험이 크게 최소화됩니다. 다른 한편으로,확률이 거짓의 반응에 따라 크게 좌 시퀀싱 오류율(으로 정의 측정 분석에 따라 달라집 signal-to-noise ratio)(1,11). 우리의 예에서 확률이 거짓이 긍정적 결과는 0.025%;그러나 평가의 잘못된 반응하지 않은 무시할 때는 감소의 로드하는 값은 가까운 오류율이 있습니다., 기존의 본질적인 설정은 오류 속도 범위 사 0.1 1%(Phred 품질의 점수를 20-30)(1,11)에 따라 시퀀싱 플랫폼,GC 의 콘텐츠에 대 지역(12),그리고 조각의 길이와 같이 Illumina 짝-end 시퀀싱(13). 따라서,탐지기종에서 VAFs<2%에 의해 영향을 받는 위험이 높은 거짓이 긍정적 결과는 관계없이,적용 범위의 깊이가 있습니다., 그것은 또한 언급하는 것이 중요합 시퀀싱 오류가 평가에 대해서만 적용됩 오류에 의해 생산 시퀀싱을 자체에 포함되지 않은 다른 오류가 소개하는 동안 DNA 처리와 라이브러리 제조,특히 동안 증폭 단계는 더욱 증가 오류율(1,11).

최소싱 범위를 임상에서 설정

는 현재 없 합의에 필요한 최소한의 범위에는 임상 조정하여 깊은 대상 resequencing 에 의해 설정,그리고 각 실험실을 설정한 자신의 매개변수를 충족하기 위해서 충분한 품질(1,5)., 날짜,몇 연구가 추천한 최소한의 범위를 기준에 대한 깊은 대상 NGS 임상에서 종양학:500 깊이의 범위와 LOD 의 5%(2),300-500 깊이의 범위는 없을 무시하고 로드(3),250 깊이 및 로드의 5%의 임계값을 조절 1,000 깊이의 범위가 필요한 경우 이종 개에서 저렴한 종양 세포질 샘플(1),100 깊이 적어도 10 변형을 읽고 LOD 의 10%(10)., 이항 데이터 분포에 따르면,250 의 커버리지 깊이는 실제로 reads≥5 를 지원하는 변형 임계 값으로 5%VAF 를 검출하기에 충분해야합니다(그림 1). 다른 한편으로,NGS 분석과 적용을 깊이의 100 와 함께 요구 사항에 적어도 10 변형을 지원하 읽으로 에릭 consortium(10)결과에 부정적인 거짓의 45%를 위한 샘플을 LOD 의 10%입니다., 을 확인 이러한 이론적 계산,우리가 수행한 두 개의 독립적인 희석 실험을 예측하의 성능 TP53NGS 분석을 감지하는 10%느리게 실행으로 평소와 같이 정상에서 깊이의 범위의 100 읽습니다. 실제로,우리는 검출 30%의 틀린 네거티브(5 긍정적인 샘플의 7 진정한 긍정적인 샘플과 9 긍정적인 샘플 13 개의 진정한 긍정적인 샘플)에서 두 개의 독립적인 시퀀싱 실행됩니다. 불행히도,위음성 비율은 종종 표적 재 시퀀싱에서 과소 평가됩니다., 또한,최근의 연구 조사하는 실험실 간의 결과는 신체적인 변종을 검출 VAFs15~50%111 과 실험실을 보고 귀하의 5~15%의(6)보여줍니다 주요 오류에 진단 NGS 발생할 수 있는 거짓에서 부정적인 결과도에서 샘플와 높은 돌연변이드(6). 3 개의 동시 위양성 결과 중 모든 변종이 올바르게 검출되었지만 오판되었다(6)., 이후 실험실되지 않은 요청하는 보고서 범위에 대한 깊이 다른 지역보다 확인 변종(6)할 수 있습만 가는 저렴한 보험 또는 높은 변화계에 기여 거짓 부정적인 결과입니다. 이러한 결과는 추가에 대한 필요성을 강조 표준화된 적용 범위 깊이에서 매개 변수 진단 NGS 계정에 오류를 시퀀싱뿐만 아니라 분석실험-특정 오류가 있습니다.

주파수의 TP53Subclonal 돌연변이 CLL 을 통해 감지 진단 NGS

을 평가하기 위해의 발생을 저렴한 느리게 실행으로 평소와 같이 정상 실제 설정에서,우리는 우리의 동의 CLL 환자는 검사에 대한 TP53mut 에서 우리의 진단 실험실입니다. TP53mut 는 이전에보고 된 것으로 평가되었다(14,15). 간단히,tp53(2bp 인트로닉 오버랩,5’및 3’UTR 을 포함하는 엑손 2-10)을 반응 당 100ng gDNA 를 사용하여 분석 하였다., Amplicon 기반 라이브러리를 시퀀싱 했으로 짝 끝에 MiSeq(2×151,Illumina)최소 표적을 읽의 깊이 x5,000. LOD 의 TP53mut 설정되었을 1%이며,개에서는 범위 1-3%에 의해 확인되었 복제입니다. 서면 동의에서 얻은 환자들에 등록에 따라 헬싱키 선언,그리고 연구에 의해 승인 되었다 로컬 윤리위원회.

859 명의 CLL 환자(2016 년 4 월~2019 년 4 월)의 진단 코호트 중 25%(215/859)가 TP53mut 에 양성이었고 그 중 52.6%(113/215)가 VAF 를 10%이하로 변종으로 옮겼다., 와 라인에서의 관찰,최근 연구(8)보고의 존재 63 84%저렴한 부담을(생어 부정)TP53muts 에 CLL 시 환자의 진단 및 치료 시,각각,그리고 확인에 부정적인 영향을 미치 전반적인 생존의 TP53muts1%이상 느리게 실행으로 평소와 같이 정상 치료 시(8).,

계산기를 위한 진단 NGS 설정의 탐지를 위한 Subclonal 돌연변이

을 돕기 위해 실험실의 결정에는 최소한 적절한 보상 매개 변수를,우리가 제공하는 간단하고,사용자 친화적인 이론 계산기(소프트웨어)를 기반으로 이항 분포(그림 2)그림 설명에서 보완 파일입니다. R 의 웹(또는 데스크톱)응용 프로그램 및 독립 실행 형 소스 코드는 github 에서 액세스 할 수 있습니다.https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., 이 계산기를 사용하여,올바른 매개변수의 시퀀싱 깊이와 해당하는 최소한의 변형을 읽기 위해 주어진 시퀀싱 오류를 평가하고 의도 LOD 쉽게 확인할 수 있다. 또한 사용자는 또한 계정으로 다른 오류가 추가하는 간단한 방법으로 분석실험-특정 오류를 시퀀싱 오류 평가 이것을 사용하여 전반적인 오류 입력으로 계산기입니다. 예를 들어,우리의 경우 TP53mutational 분석는 우리로 계산된 전반적인 오류~1.16%,따라서 우리는 우리의 최소한의 범위를 깊이있는 요구 사항에 2,000 명의 임계값과 최소한의 40 읽기 위한 3%느리게 실행으로 평소와 같이 정상.,

토론

지 진단 NGS 를 얻고 있는 굴지에 있는 임상 설정에 대한 평가의 체세포 변이 암에 부족의 표준화 시퀀싱 매개변수도 제한을 구현 임상 연습에서(1),주로 개에 존재하는 저전 주파수(4). 우리는,따라서 해결 기술적인 문제의 결정이 올바르게 시퀀싱 깊이에서 진단 NGS 을 얻기 위해서 자신감 및 재현 가능한 탐지의 낮은 느리게 실행으로 평소와 같이 정상 변형이 있습니다., 특히,우리가 수행한 이론적인 계산을 결정하는 최적의 깊이의 범위는 검출 성능의 개에서 저렴한 대립 주파수를 계정에 오류가 시퀀싱율입니다. 또한,우리는 희석 실험을 수행함으로써 이러한 이론적 계산을 확인했다. 이러한 관찰을 바탕으로,우리의 깊이 범위의 1,650 이상(과 함께 각각의 문턱에서 적어도 30 돌연변이를 읽고)호출≥3%개를 달성하 99.9%의 확률의 변형을 검출을 사용하여,기존의 NGS 시퀀싱 오류가니다., 개에는 1~3%느리게 실행으로 평소와 같이 정상 범위 경우에만 호출할 수 있습니다 얻은 시퀀스는 데이터는 높은 품질(평균 Q30>90%)및/또는 때 개가에 의해 확인 복제하거나 직각 방법(1,11,16). 우리는 또한 제공,간단한 사용자 친화적인 이론 계산기(소프트웨어)을 돕기 위해 실험실로 해결하는 올바른 시퀀싱 깊이와 해당하는 최소한의 변형을 읽는 동안 계정에 오류가 시퀀싱율입니다. 우리의 간단한 계산기는 진단 NGS 에서 위양성 및 위음성 결과를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.,

그럼에도 불구하고,정확한 시퀀싱 깊이는 또한 분석 특이적인 요인(1)에 의해 영향을 받는다. 오류는 DNA 처리 및 라이브러리 준비 중 여러 단계에서 발생할 수 있습니다. 가장 일반적인 것은 ngs 라이브러리 준비 중에 도입 된 증폭 오류입니다(1,12,17). 다른 일반적인 원인 오류가 해야 하는 라이브러리와 복잡성(숫자의 독립적인 DNA 분자 분석),DNA 품질,및 대상 지역의 복잡성 등등. 모든 잠재적 분석 특정 오류는 테스트 설계,방법 검증 및 품질 관리를 통해 해결되어야합니다.,

현재 신흥,오류정정 전략을 모두 계산 및 실험,개발되고 있 줄이기 위해서는 높은 오류가 요금 진단 NGS(11). 그래서 멀리 가운데,가장 유망한 오류정정 방법은 UMI(분자 독특한 식별자)에 대한 올바른 PCR 오류(18),그리고 신호 대 잡음 교정 접근법(11). 이러한 진보는 LOD 를 줄이려고 시도하여 ngs 진단에서 향후 기회에 필요한 시퀀싱 정확도를 높입니다.,

을 향상시키기 위해 표준화를 진단 NGS,의 추정 정확한 적용을 깊이의 권장 출발점을 평가할 때 임계값 주변의 특정 NGS 분석하지 않아도 됩니다. 그럼에도 불구하고,거기에 여전히 부족하의 게시한 지침에 대한 최소한 기술 요건 및 보고서 NGS,특히 중요한의 탐지에서 클론 및 subclonal 돌연변이 암 진단을 수행합니다., 이 때문에 주로 광범위한 라이브러리 제조 방법,그리고 수많은 변수의 역할을에서 각각의 특정 NGS 분석 결과는 어려운 표준과 함께,실험실 간 변화. 따라서 최소 기술 요구 사항의 정의와 NGS 에서의 그보고는 매우 바람직합니다., 서 우리의 경험을 바탕으로 진단 NGS 에 haemato-종양학과,우리가 제안하는 보고서 적어도 다음과 같은 기술적인 매개변수:LOD,전반적인 오류의 NGS 분석 결과(또는 적어도 시퀀싱 오류가율),DNA 의 양의 입력 소스,그리고 품질의 DNA,최소한의 범위를 깊이와 비율의 대상으로 기지에서 시퀀싱이 최소한 깊이,총 수의 목표를 읽고 변형을 덮는 지역 및 번호의를 읽을 지원하는 변형이 있습니다. 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE)샘플(19,20)의 NGS 표준화에 특별한 중점을 두어야한다.,

함께 찍은 우리의 학문의 중요성을 강조 시퀀싱이 올바른 깊이와 최소의 숫자를 읽는 데 필요한 안정적이고 재현 가능한 감지 변종의 저렴한 느리게 실행으로 평소와 같이 정상 진단 NGS. 계산 시퀀싱이 올바른 깊이를 지정한 오류율이 우리를 사용하여 사용자 친화적인 이론 계산기(소프트웨어)데 도움이 될 수 있습을 최소화하는 긍정 오류 및 부정적인 결과를 진단 NGS,상황에서 관련된 subclonal 돌연변이 있습니다., 엄격한 테스트와 표준화된 최소 요구 사항에 대한 진단 설정은 특히지 확인하는 것이 바람직하다 정확한 결과를 임상에서 설정합니다.

데이터 가용성

데이터 생성을 위해 본 연구에서 사용할 수 있 합리적인 요청이 해당 저자이다.

저자 기고

ap 와 EK 는 연구를 설계하고 결과를 해석하고 원고를 썼다. AP,LS,TD 및 PS 는 NGS 분석을 수행했습니다. TP 는 환자 샘플과 임상 데이터를 수집했습니다. MV 는 생물 정보학 분석을 수행하고 계산기 코드를 작성했습니다. TN 은 웹 응용 프로그램을 준비했습니다., 모든 저자는 원고의 최종 버전을 읽고 승인했습니다.

자금 조달

보조금 지원:mz CR VES16-32339A,부분적으로 MH CZ—DRO(FNOl,00098892).

이해의 충돌 문

저자가 선언하는 연구가 수행되었의 부재에서 어떠한 상업 또는 금융 서비스를 제공하는 것으로 해석될 수 있는 잠재적인 이해의 충돌.

인정

우리는 참조 제한 때문에 기사를 인용 할 수없는 많은 저자들에게 사과드립니다.,

Supplementary Material