Good Mood

결과 및 토론

Arabidopsis cDNA 라이브러리 상영되었을 사용하여 35S-labeled 캠-binding 심사 접근 방법으로 설명(24). 양성 클론 중 하나는 데이터베이스에서 AtCat3 과 동일한 뉴클레오티드 서열을 나타냈다(GenBank 가입 번호. U43147). 을 증명하는 AtCat3 인코딩된 캠-인 단백질 전체 코딩의 지역 AtCat3 었 subcloned 로 pET14b 식 벡터입니다. 재조합 AtCat3 는 이소 프로필 β-d-thiogalactoside(IPTG)에 의해 유도되었다(도 1)., 1a)및 CaM 친 화성 크로마토 그래피에 의해 거의 균질성으로 정제되었다. 총 박테리아 추출물을 CaM-결합 분석법에 사용하였고,35S-표지 된 CaM 이 Ca2+의 존재하에 AtCat3 단백질에 결합하는 것으로 나타났다(도 2). 1A). EGTA 를 첨가 한 후,캠 결합은 관찰되지 않았다. 또한,35s-표지 된 CaM 은 CaCl2 가 MgCl2 또는 MnCl2 와 같은 다른 2 가 양이온으로 대체 될 때 AtCat3 에 결합하지 않았다(도 1). 1A),AtCat3 에 대한 CaM 바인딩이 Ca2+의존적임을 시사한다.

를 식별하는 캠-바인딩을 지역에서 AtCat3,두 C 터미널 삭제 돌연변이 사용되었 35S-캠무적인 분석 실험. 0 의 면전에서.,2mM Ca2+,CaM 은 야생형과 돌연변이 1-451 에 결합하는 반면,CaM 은 돌연변이 1-414 에 결합하지 않았다(도 1). 1B),AtCat3 에 대한 CaM-결합 영역이 아미노산 415-451 로 제한됨을 시사한다. AtCat3 에 대한 CaM 결합을 추가로 확인하기 위해,AtCat3 의 아미노산 415-451 에 해당하는 합성 펩타이드를 CaM 으로 배양 하였다. 펩타이드-캠 복합체의 형성은 nondenaturing PAGE 에 의해 평가되었다. 36-mer 펩타이드는 Ca2+의 존재하에 CaM 과 안정한 복합체를 형성 할 수있다(도 2). 1 기음). 펩타이드가없는 경우 단일 캠 밴드가 관찰되었습니다., 펩타이드 농도가 증가함에 따라,펩타이드-캠 복합체를 나타내는 낮은 이동성을 갖는 또 다른 밴드가 나타났다. 할 때 몰 사이의 비율은 펩타이드와 캠 1:1 만이 있는 펩타이드 복잡한 캠 밴드이 검색되었음을 나타내는 단 하나의 캠-바인딩 사이트에서 펩티드. Egta 의 존재 하에서 펩타이드-캠 복합체가 형성되지 않았다(도 1). 1 기음). 이러한 결과는 cam 이 칼슘 의존적 인 방식으로 atcat3 에 특이 적으로 결합 함을 나타낸다.

카탈라아제는 거의 모든 호기성 유기체에 존재합니다. 동물에서는 단일 유전자에 의해 암호화 된 카탈라아제 이소 형태가 하나뿐입니다., 대조적으로,식물의 카탈라아제는 작은 유전자 패밀리에 의해 암호화 된 다중 이소 형으로 존재한다(6,26). 적어도 이것은 옥수수와 같은 단핵구 및 카탈라아제가 잘 특징 지어지는 담배,아라비돕시스 및 호박과 같은 dicots 에서 사실입니다. 흥미롭게도,이들 각각은 3 개의 유전자에 의해 암호화 된 3 개의 이소 형을 갖는다. 지 여부를 결정하는 모든 카탈라제가 있 캠-바인딩 지역,아미노산 시퀀스의 37 카탈라제에서는 박테리아,동물,식물을 비교 했을 사용하여 경주에 집중 프로그램에서 GCG10 패키지입니다., 아미노산 서열 비교는 N-말단 384aa(약 60%유사성 및 50%정체성)에서 매우 높은 상 동성을 나타냈다. 그러나 CaM-결합 영역이 위치한 C-말단 108aa 에서는 AtCat3 과 다른 비 식물 카탈라아제(약 21%상 동성 및 14%정체성)사이의 유사성이 거의 없었다. 그럼에도 불구하고,모든 식물 보여주는 카탈라제 고 homology 에서는 이 부분(about78%homology70%identity),특히 지역에서 해당하는 캠-바인딩을 지역에서 AtCat3. 도. 도 2 는 13 개의 대표적인 카탈라아제의 C-말단 108-aa 서열 비교를 도시한다., 아미노산 시퀀스에는 것을 특징으로 하는 캠-인 단백질이 있지 보존에서 캠-바인딩 지역 대부분의 그들의 보조 구조적 기능,기본적 양쪽 α-helix(27)같은 auxin 단백질 ZmSAUR1(24)및 식물 chimeric Ca2+/CaM protein kinase(28). 캠 결합 영역에는 종종 음으로 하전 된 아미노산이 있지만 순 전하는 양성이라는 점에 유의하십시오(16). GCG 프로그램을 이용한 헬리컬 휠 프로젝션에 기초하여,AtCat3 의 아미노산 438-451 이 염기성 양극성 α-나선을 형성 할 수 있다고 결정되었다., 헬리컬 휠의 한면이 소수성이고 다른면이 순 양전하로 친수성이라는 것이 분명합니다. 분석의 아미노산 시퀀스가 해당하는 캠-바인딩 지역의 AtCat3 의 존재를 예측은 기본적 양쪽 α-helix 에서 몇 가지의 다른 공장 카탈라제. 흥미롭게도,중 세 catalase isoforms 에서 옥수수,담배,Arabidopsis,호박,적어도 하나의 isoform 으로 양쪽 α-나선형 구조에서 각 종이,예를 들어,,,tobacco1(아미노산 431-444),maize3(아미노산 442-455),그리고 pumpkin1(아미노산 438-451),뿐만 아니라 Arabidopsis AtCat1(아미노산 438-451). 모든 식물 종에 대해 사실인지 여부는 GenBank 의 다른 식물 종에 대한 제한된 카탈라아제 서열 때문에 명확하지 않다. 에 따라 결정 구조의 데이터 세균 및 포유류는 카탈라제,α-나선형 구조물 C 터미널에서 여러분의 카탈라제(29)지만,기본적 양쪽 α-나선형 구조물에 존재하는 이 부분에 따라 나선형 휠이션할 수 있도록 합니다.,

CaM 이 planta 로부터 정제 된 카탈라아제에 결합하는지 여부를 시험하기 위해,durner 와 Klessig(10)에 기초하여 잎으로부터 담배 카탈라아제를 정제 하였다. CaM-Sepharose 칼럼은 정화 공정의 마지막 단계로 사용되었습니다. 1,000g 의 담배 잎을 사용한 카탈라아제의 정제 단계의 요약은 표 1 에 제시되어있다. 담배 카탈라아제는 SDS/PAGE 및은 염색에 의해 판단 된 바와 같이 거의 균질성으로 정제되었다(도 1). 3,레인 1). 카탈라아제 신원은 담배 카탈라아제에 대한 mAb 로 웨스턴 블로 팅에 의해 확인되었다(도 1). 3,레인 3)., 정제 된 담배 카탈라아제에 대한 캠 결합은 다음의 접근법에 의해 입증되었다. (i)담배 카탈라아제의 정제를 위해 CaM-Sepharose 칼럼을 사용 하였다. 이 단계의 회수율은 81%였으며(표 1),담배 잎에서 나온 카탈라아제의 대부분이 캠 결합 단백질임을 시사한다. (ii)35S-표지 된 CaM 은 0.2mM CaCl2 의 존재 하에서 정제 된 카탈라아제에 대한 결합을 시험하는데 사용되었다(도 2). 3,레인 5). 재조합 AtCat3 을 대조군으로 사용 하였다(도 1). 3,차선 2,4 및 6). 0 의 추가.,4mM EGTA 는 CaM 결합을 폐지하여 CaM 이 Ca2+의존적 방식으로 식물 카탈라아제에 결합 함을 시사한다. 그것이 곰팡이,소 또는 인간 카탈라아제에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 캠 결합 분석법도 수행되었다. 결과 밝혀 없는 이러한 nonplant 카탈라제 보여 모든 캠 바인딩(데이터시하지 않음)계약과 함께 아미노산 시퀀스를 비교(Fig. 2).,

캠-바인딩 사이트 또는 밀접하게 나란히 지역에서 다른 특징 캠-인 단백질은 종종 기능으로 autoinhibitory 또는 pseudosubstrate 도메인이 있습니다. 이 영역은 식물 키메라 Ca2+/CaM 의존성 단백질 키나아제(30)및 글루타메이트 탈 카르 복실 라제(31)와 같이 Ca2+신호가없는 상태에서 표적 단백질을 비활성 상태로 유지합니다. 을 연구의 중요성 캠 바인딩 공장 카탈라제,촉매활동의 재조합 AtCat3 및 순화한 담배 catalase 측정 존재와 부재의 CaCl2 및 캠입니다., 유사한 실험은 또한 다른 비 식물 카탈라아제를 사용하여 수행되었다. 대장균 발현 재조합 AtCat3 는 활성을 나타내지 않았다. 비슷한 결과가 다른 실험실(Zhixiang Chen,개인 통신)에서 얻어졌습니다. 이 초래할 수 있습니다 수 있습에서 실패하는 형태의 정확한 구조에 대한 재조합 catalase 기 때문에 활성 catalase is a tetramer made up of four 동일 또는 유사한 subunits(6,10,26). 대조적으로,정제 된 담배 카탈라아제는 정제 단계 동안 활성에서 유의 한 Ca2+/CaM-의존적 변화를 나타냈다(표 1)., Ca2+/CaM 의 자극 효과는 CaM-Sepharose 크로마토 그래피 후에 얻은 샘플을 제외하고 각 단계에서 약 2.2 배입니다. 그것은 아마도 비 Ca2+/CaM-결합 카탈라아제 분획의 제거 때문에 카탈라아제 활성(2.5 배)의 더 높은 자극을 나타냈다(표 1). 비 Ca2+/CaM-결합 카탈라아제 분획은 59.6 단위(기초 활성)의 특정 활성을 가졌다. 그러나,Ca2+/CaM 은 카탈라아제의이 분획의 활성을 자극하지 않았다(데이터는 표시되지 않음)., 이러한 결과를 나타내는 Ca2+/CaM 를 활성화할 수 담배 catalase 에서 분수로 취득한 후 캠-Sepharose 크로마토그래피로에 해당하는 캠-바인딩 결과입니다. 의 효과 비교 Ca2+/CaM 의 활동에는 카탈라제는 서로 다른 소스에서,관계되는 활동에 사용 되었기 때문에,거기에서 상당한 차이가 특정 활동의 카탈라제에서 다른 종입니다. 예를 들어,니제르 catalase 는 특정 활동의 5.7 단위;소 간 catalase,51.9 단위,바람 적혈구,39.5 단위,담배 catalase,63.,1 단위(Ca2+/CaM 의 부재). 도. 도 4A 는 CaCl2 단독 또는 CaM 단독이 담배 카탈라아제 활성에 자극 효과가 없음을 보여준다(최대 활성의 약 40%). 촉매 활성의 차이는 Ca2+,CaM 및 Ca2+/CaM 의 존재 또는 부재하에 곰팡이,소 또는 인간 카탈라아제에서 관찰되지 않았다(도 1). 4A). CaCl2 를 MgCl2 로 대체함으로써 cam 의 존재 또는 부재 하에서 담배 카탈라아제 활성에 유의 한 변화가 없었다(데이터는 표시되지 않음)., 추가 문서의 효과 Ca2+/CaM 공장에 catalase 활동,10µM 의 펩타이드 해당하는 AtCat3 캠-binding region(415-451)추가 되었을 각각 반응합니다. 비식물성 카탈라아제는 펩티드의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나,담배 카탈라아제 활성에 대한 Ca2+/CaM 의 자극 효과는 펩타이드의 첨가에 의해 폐지되었다(도 1). 4A). 또한,담배 카탈라아제 활성에 대한 펩타이드의 억제 효과는 펩타이드의 농도에 의존했다(도 1). 4B)., 카탈라아제 활성은 약 58%억제되었으며,이는 카탈라아제의 기저 활성에 가깝다. 그러나,펩타이드는 시험 된 모든 농도에서 소 카탈라아제 활성에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 1). 4A). 이러한 결과는 Ca2+/CaM 이 정제 된 식물 카탈라아제에 자극 효과를 나타내지 만 비 식물 카탈라아제에는 효과가 없음을 시사한다.

는 것이 알려져 catalase 주된솜과 퍼옥시솜 효소,하지만 그것 또한 존재한 미토콘드리아에서 세포질(32). 예를 들어,아미노산 서열 비교에 기초한 CaM-결합 카탈라아제 일 수있는 옥수수 Cat3 는 미토콘드리아 단백질(33)이다. 우리의 결과(무화과. 1-4)는 cam 이 식물 카탈라아제에 결합하여 그 활성을 조절한다는 것을 입증한다. 생체 내에서이 조절 활성의 존재를 입증하기 위해,우리는 cam 이 식물의 퍼 옥시 솜에서 카탈라아제와 공존하는지 여부를 연구했다., Etiolated 호박 자엽 추출물로부터의 세포 소기관은 자당 밀도 원심 분리에 의해 분리되었다. 을 오염을 제거의 세포내 단백질이에서 존재할 수 있는 솔루션 또는 단순히 관련된솜과 퍼옥시솜 막 절연 peroxisomes 취급 되었으로 가수분해 K. 이 방법으로,다솜과 퍼옥시솜 단백질로부터 보호 단백질에 의해솜과 퍼옥시솜 막지 않았습을 소화(34,35). 퍼 옥시 좀 분획의 정체성은 카탈라아제 활성을 측정함으로써 입증되었다(35)., CaM 은 왕국(13-16)에 걸쳐 매우 보존되어 있으므로 우리는 항 인간 CaM 항체로 서양 분석을 수행했습니다. 대조군으로서,재조합 감자 캠 PCM6 을 사용 하였다(도 1). 5,레인 3). 흥미롭게도,PCM6 과 유사한 크기의 밴드가 peroxisomal 분획에 존재했지만,강도는 cytosolic CaM 에 비해 상당히 낮았다(도 1). 5). 이러한 결과는 cam 과 catalase 가 peroxisomes 에서 colocalized 것을 나타냅니다. CaM 은 주로 세포질에서 발현되는 작은 산성 단백질입니다., 그러나 식물에서 CaM 은 핵과 엽록체(36,37)와 세포 외 기질(38)과 같은 여러 세포 소기관에 존재하는 것으로 나타났다. 또한 CaM 조절 단백질은 세포 외 기질,핵 및 엽록체에 존재합니다(38-40). 캠이 막을 가로 지르는 방법은 명확하지 않습니다. 최근의 연구에 따르면 사후 변형은 일부 CaM isoforms 의 전좌에 중요한 역할을합니다. 예를 들어,피튜니아 CaM-유사 단백질 인 CaM53 은 단백질이 prenylated 될 때 혈장 막과 관련이있다. Prenylation 이 억제되면 cam53 은 주로 핵에서 발견됩니다(41).,

우리의 지식이 없고 설명하는 칼슘 농도에서 peroxisomes., Peroxisome biogenesis 의 최근 변형 된 모델에 기초하여,peroxisome 은 preperoxisomal vesicles(42)에 의해 endoplasmic reticulum(ER)에서 유래한다. 응급실은 세포 내 칼슘 풀 중 하나 인 것으로 알려져 있습니다. 따라서,퍼 옥시 좀의 칼슘 농도는 응급실 에서처럼 높을 수 있습니다. 측정솜과 퍼옥시솜 칼슘 농도를 모니터링 사이의 링크를 변경하는 칼슘의 농도에서는 세포질 peroxisome 에 도움이 됩니다 우리는 방법에 대한 이해솜과 퍼옥시솜 catalase 에 의해 규제 Ca2+/CaM., 예를 들어,유리 칼슘 농도는 peroxisome-표적화 신호를 갖는 재구성 된 aequorin 으로 형질 전환 식물에서 측정 될 수있다. Aequorin 은 칼슘에 민감한 발광 단백질이며,발광은 칼슘 변화를 직접보고합니다(43). 기 때문에 peroxisome 중요한 세포기관을 제거하는 유독한 선생님,주로 H2O2,그것은 합리적인 추측하는솜과 퍼옥시솜 catalase 활동이 높은 남아있는 모든 시간의 저하 H2O2 현장에서 빠른 속도로. 그러나,세포 성 칼슘의 변동은 세포 성 카탈라아제 활성에 큰 영향을 미칠 수있다., 모든 카탈라아제가 캠 결합 단백질이 아니라는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 따라서,다른 세포 소기관에서 카탈라아제 활성을 제어하는 데있어 Ca2+/CaM 의 중요성을 다루기 위해서는 추가 조사가 필요하다.

Biotic and abiotic 트리거 Ca2+유입,그리고 증가 cytosolic Ca2+의 생성을 자극한 H2O2 는 확산으로 주변의 세포 메신저을 유도하는 생리적 반응(19,20). 우리의 결과는 증가 된 세포 성 Ca2+가 카탈라아제 활성의 Ca2+/CaM 매개 자극에 의해 H2O2 수준을 감소시킬 수 있음을 시사한다(도 1). 4)., 우리는 증가 된 cytosolic Ca2+가 H2O2 항상성 조절에 이중 역할을한다고 제안한다(그림 2). 6):(i)긍정적인 규제가 생성 H2O2 에 의해 직접적 활성화 NADPH 산화은 선호도를 Ca2+(22)그리고 간접적으로 더 많은 생산 NADPH 에 의해 Ca2+/CaM 규제 NAD 키(23);and(ii)부정적인 규제는 H2O2 를 감소에 의해 자극 catalase 활동을 통해 Ca2+/CaM 변조(그림. 4)., 신호의 변화를 유도 Ca2+과도 다를 수 있습니다에서 주파수,기간,진폭,그리고 공간적인 현지화의 진동,그리고 모드 공간에 전파로 연결하여 차등에 효과 칼슘을 타겟 단백질(12,44).