DISKUSSION
Der Gram Stain ist das am häufigsten verwendete Färbeverfahren in der Bakteriologie. Es wird als Differentialfleck bezeichnet, da es zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien unterscheidet. Bakterien, die mit dem Gram-Färbeverfahren lila färben, werden als grampositiv bezeichnet; Diejenigen, die rosa färben, sollen gramnegativ sein. Die Begriffe positiv und negativ haben nichts mit elektrischer Ladung zu tun, sondern bezeichnen einfach zwei verschiedene morphologische Bakteriengruppen.,
Grampositive und gramnegative Bakterien verfärben sich aufgrund grundlegender Unterschiede in der Struktur ihrer Zellwände unterschiedlich. Die bakterielle Zellwand dient dazu, dem Organismus seine Größe und Form zu geben sowie eine osmotische Lyse zu verhindern. Das Material in der bakteriellen Zellwand, das Steifigkeit verleiht, ist Peptidoglycan.
In Elektronenmikrographen erscheint die grampositive Zellwand als breite, dichte Wand, die 20-80 nm dick ist und aus zahlreichen miteinander verbundenen Peptidoglycanschichten besteht (Abbildungen 1A und 1B). Chemisch sind 60 bis 90% der grampositiven Zellwand Peptidoglycan., In der Zellwand von Grampositiven sind Teichoesäuren verwoben. Teichoesäuren, die sich durch und über den Rest der Zellwand erstrecken, bestehen aus Polymeren aus Glycerin, Phosphaten und dem Zuckeralkohol Ribitol. Einige haben ein Lipidsystem (Lipoteichoesäure). Die äußere Oberfläche des Peptidoglycans ist mit Proteinen besetzt, die sich mit dem Stamm und der Art des Bakteriums unterscheiden.,
Die gramnegative Zellwand hingegen enthält nur 2-3 Schichten Peptidoglycan und ist von einer äußeren Membran umgeben, die aus Phospholipiden, Lipopolysaccharid, Lipoprotein und Proteinen besteht (Abbildungen 2A und 2B). Nur 10% – 20% der gramnegativen Zellwand ist Peptidoglycan. Die Phospholipide befinden sich hauptsächlich in der inneren Schicht der äußeren Membran, ebenso wie die Lipoproteine, die die äußere Membran mit dem Peptidoglykan verbinden., Die Lipopolysaccharide, die sich in der äußeren Schicht der äußeren Membran befinden, bestehen aus einem Lipidabschnitt, der Lipid A genannt wird, das in die Membran eingebettet ist, und einem Polysaccharidabschnitt, der sich von der Bakterienoberfläche nach außen erstreckt. Die äußere Membran enthält auch eine Reihe von Proteinen, die sich mit dem Stamm und der Art des Bakteriums unterscheiden.,
Weitere Informationen zur gramnegativen und grampositiven Zellwand finden Sie in den folgenden Lernobjekten in Ihrem Vorlesungsleitfaden:
- Die prokaryotische Zellwand; Einheit 1, Abschnitt IIB2
- Die grampositive Zellwand; Einheit 1, Abschnitt IIB2a
- Die gramnegative Zellwand; Einheit 1, Abschnitt IIB2b
Das Gram-Färbeverfahren umfasst vier grundlegende Schritte:
1. Die Bakterien werden zuerst mit dem Grundfarbstoff Crystal violet gefärbt. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien verfärben sich direkt und erscheinen nach diesem Schritt violett.,
2. Die Bakterien werden dann mit Grams Jodlösung behandelt. Dadurch kann der Fleck besser zurückgehalten werden, indem ein unlöslicher Kristallviolett-Jod-Komplex gebildet wird. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien bleiben nach diesem Schritt lila.
3. Grams Entfärbungsmittel, eine Mischung aus Ethylalkohol und Aceton, wird dann zugegeben. Dies ist die differentielle Schritt. Grampositive Bakterien behalten den Kristallviolett-Jod-Komplex, während gramnegative entfärbt werden.
4. Schließlich wird der Gegenlack Safranin (auch ein Grundfarbstoff) aufgetragen., Da die grampositiven Bakterien bereits lila gefärbt sind, sind sie vom Gegenstrich nicht betroffen. Gramnegative Bakterien, die jetzt farblos sind, werden direkt von th e Safranin befleckt. So erscheinen Grampositive lila und gramnegative rosa.
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, Autoren, Lizenziert für die Verwendung von ASM MicrobeLibrary.,
Mit der aktuellen Theorie hinter der Gram-Färbung wird angenommen, dass sich das Kristallviolett und das Jod bei grampositiven Bakterien zu einem größeren Molekül verbinden, das in der Zelle ausfällt. Das Alkohol / Aceton-Gemisch bewirkt dann eine Dehydrierung des mehrschichtigen Peptidoglycans, wodurch der Raum zwischen den Molekülen verringert wird und die Zellwand den Kristallviolett-Jod-Komplex innerhalb der Zelle einfängt., Bei gramnegativen Bakterien löst das Alkohol/Aceton-Gemisch als Lipidlösungsmittel die äußere Membran der Zellwand auf und kann auch die Zytoplasmamembran schädigen, an der das Peptidoglycan befestigt ist. Die wenigen Schichten von Peptidoglycan können den Kristallviolett-Jod-Komplex nicht zurückhalten und die Zelle wird entfärbt.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Grampositivität (die Fähigkeit, den violetten Kristallviolett-Jod-Komplex beizubehalten) kein All-oder-Nichts-Phänomen ist, sondern eine Frage des Grades., Es gibt mehrere Faktoren, die dazu führen könnten, dass ein grampositiver Organismus gramnegativ färbt:
1. Die verwendete Methode und Techniken. Überhitzung während der Hitzebefestigung, übermäßige Entfärbung mit Alkohol und sogar zu viel Waschen mit Wasser zwischen den Schritten können dazu führen, dass grampositive Bakterien den Kristallviolett-Jod-Komplex verlieren.
2. Das Zeitalter der Kultur. Kulturen, die älter als 24 Stunden sind, können ihre Fähigkeit verlieren, den Kristallviolett-Jod-Komplex beizubehalten.
3. Der Organismus selbst., Einige grampositive Bakterien können den Kristallviolett-Jod-Komplex besser zurückhalten als andere.
Daher muss man bei der Gramfärbung sehr präzise Techniken anwenden und die Ergebnisse diskret interpretieren.
Trypticase-Soja-Agar-Plattenkulturen von Escherichia coli (einem kleinen gramnegativen Bazillus) und Staphylococcus epidermidis (einem grampositiven Kokkus mit Staphylokokkenanordnung).
VERFAHREN (einzeln durchzuführen)
1., Escherichia coli
ein. Wärme-fix ein Abstrich von Escherichia coli wie folgt:
1. Legen Sie mit der Tropfenflasche mit deionisiertem Wasser in Ihrem Färberegal 1/2 eines normal großen Wassertropfens auf einen sauberen Objektträger, indem Sie den Tropfer mit dem Objektträger berühren (Abbildung 1). Verwenden Sie alternativ Ihre sterilisierte Impfschlaufe, um einen Tropfen deionisiertes Wasser auf die Folie zu legen.
2., Entfernen Sie mit Ihrer sterilen Impfschlaufe aseptisch eine kleine Menge der Kultur von der Agaroberfläche und berühren Sie sie 2 – 3 Mal vorsichtig mit dem Wassertropfen, bis das Wasser sichtbar trüb wird (Abbildung 2). Ein guter Abstrich mit der richtigen Menge an Bakterien ist für die Gramfärbung unerlässlich.
- Zu viele Bakterien auf dem Objektträger können zu einer Unterentfärbung führen; zu wenige können zu einer Überentfärbung führen.
3. Verbrennen Sie die verbleibenden Bakterien auf der Impfschleife., Wenn dem Wasser zu viel Kultur zugesetzt wird, sehen Sie keine befleckten einzelnen Bakterien und haben möglicherweise keinen zuverlässigen Gramfleck.
4. Nachdem die Impfschlaufe abgekühlt ist, verteilen Sie die Suspension auf etwa der Hälfte des Objektträgers, um einen dünnen Film zu bilden. Ein richtig vorbereiteter Abstrich mit der richtigen Menge Bakterien sollte ähnlich aussehen wie Abb. 3.
5. Lassen Sie diese dünne Suspension vollständig an der Luft trocknen (Abbildung 4). Der Abstrich muss vollständig trocken sein, bevor der Schlitten hitzebeständig ist!
6., Um die Bakterien am Objektträger zu fixieren, nehmen Sie den luftgetrockneten Objektträger mit einer Coverslip-Pinzette auf und halten Sie den Boden des Objektträgers gegenüber dem Abstrich 10 Sekunden lang in der Nähe der Öffnung des Mikroincinerators (Abbildung 5), wie von Ihrem Ausbilder gezeigt. Wenn der Schlitten nicht genug erhitzt wird, werden alle Bakterien abgewaschen. Wenn es überhitzt ist, kann die strukturelle Integrität der Bakterien beschädigt werden.
b. Eine Minute lang mit Huckers Kristallviolett färben (Abbildung 6). Vorsichtig mit Wasser waschen (Abbildung 7). Schütteln Sie das überschüssige Wasser ab, aber tupfen Sie es nicht zwischen den Schritten trocken.
c., Mit Grams Jodlösung eine Minute lang einfärben (Abbildung 8) und vorsichtig mit Wasser abwaschen.
d. Entfärben Sie, indem Sie die Folie aufnehmen und den Entfärberer des Grams die Folie herunterlaufen lassen, bis das Purpur am unteren Rand der Folie nicht mehr fließt (Abbildung 9).
- Stellen Sie sicher, dass der gesamte Abstrich gleichmäßig entfärbt ist und Sie nicht unter-oder überfärben.
- Sofort mit Wasser abwaschen.
e. Eine Minute mit Safranin färben (Abbildung 10)., Wenn Sie das überschüssige Safranin abwaschen, seien Sie sehr vorsichtig, vorsichtig und kurz zu waschen, da es möglich ist, einen Teil des Sarfanins im Bakterium auszuwaschen.
f. Trocken tupfen (Abbildung 11) und mit Ölimpulsmikroskopie beobachten.
2. Staphylococcus epidermidis
ein. Wärme-fix ein Abstrich von Staphylococcus epidermidis wie folgt:
1. Legen Sie mit der Tropfenflasche mit deionisiertem Wasser in Ihrem Färberegal 1/2 eines normal großen Wassertropfens auf einen sauberen Objektträger, indem Sie den Tropfer mit dem Objektträger berühren (Abbildung 1)., Verwenden Sie alternativ Ihre sterilisierte Impfschlaufe, um einen Tropfen deionisiertes Wasser auf die Folie zu legen.
2. Entfernen Sie mit Ihrer sterilen Impfschlaufe aseptisch eine kleine Menge der Kultur von der Agaroberfläche und berühren Sie sie 2 – 3 Mal vorsichtig mit dem Wassertropfen, bis das Wasser sichtbar trüb wird (Abbildung 2).
- Zu viele Bakterien auf dem Objektträger können zu einer Unterentfärbung führen; zu wenige können zu einer Überentfärbung führen.
3. Verbrennen Sie die verbleibenden Bakterien auf der Impfschleife., Wenn dem Wasser zu viel Kultur zugesetzt wird, sehen Sie keine befleckten einzelnen Bakterien und haben möglicherweise keinen zuverlässigen Gramfleck.
4. Nachdem die Impfschlaufe abgekühlt ist, verteilen Sie die Suspension auf etwa der Hälfte des Objektträgers, um einen dünnen Film zu bilden (Abbildung 3).
5. Lassen Sie diese dünne Suspension vollständig an der Luft trocknen (Abbildung 4). Der Abstrich muss vollständig trocken sein, bevor der Schlitten hitzebeständig ist!
6., Um die Bakterien am Objektträger zu fixieren, nehmen Sie den luftgetrockneten Objektträger mit einer Coverslip-Pinzette auf und halten Sie den Boden des Objektträgers gegenüber dem Abstrich 10 Sekunden lang in der Nähe der Öffnung des Mikroincinerators (Abbildung 5), wie von Ihrem Ausbilder gezeigt. Wenn der Schlitten nicht genug erhitzt wird, werden alle Bakterien abgewaschen. Wenn es überhitzt ist, kann die strukturelle Integrität der Bakterien beschädigt werden.
b. Eine Minute lang mit Huckers Kristallviolett färben (Abbildung 6). Vorsichtig mit Wasser waschen (Abbildung 7). Schütteln Sie das überschüssige Wasser ab, aber tupfen Sie es nicht zwischen den Schritten trocken.
c., Mit Grams Jodlösung eine Minute lang einfärben (Abbildung 8) und vorsichtig mit Wasser abwaschen.
d. Entfärben Sie, indem Sie die Folie aufnehmen und den Entfärberer des Grams die Folie herunterlaufen lassen, bis das Purpur am unteren Rand der Folie nicht mehr fließt (Abbildung 9).
- Stellen Sie sicher, dass der gesamte Abstrich gleichmäßig entfärbt ist und Sie nicht unter-oder überfärben.
- Sofort mit Wasser abwaschen.
e. Eine Minute mit Safranin färben (Abbildung 10)., Wenn Sie das überschüssige Safranin abwaschen, seien Sie sehr vorsichtig, vorsichtig und kurz zu waschen, da es möglich ist, einen Teil des Sarfanins im Bakterium auszuwaschen.
f. Trocken tupfen und mit Ölimpulsmikroskopie beobachten.
3. Stellen Sie sicher, dass Sie den verwendeten Farbstoff vorsichtig in Ihr Färbefach in den Abfallfarbstoffsammelbehälter gießen, nicht in die Spüle.
B., DER KAPSELFLECK
Viele Bakterien scheiden eine schleimige, viskose Hülle aus, die Kapsel oder Glykokalyx genannt wird . Dies besteht normalerweise aus Polysaccharid, Polypeptid oder beidem.
Die Fähigkeit, eine Kapsel zu produzieren, ist eine vererbte Eigenschaft des Organismus, aber die Kapsel ist keine absolut essentielle zelluläre Komponente. Kapseln werden oft nur unter bestimmten Wachstumsbedingungen hergestellt. Auch wenn Kapseln nicht lebensnotwendig sind, helfen sie Bakterien, in der Natur zu überleben., Kapseln helfen vielen pathogenen und normalen Flora-Bakterien, zunächst Phagozytose durch die Phagozytenzellen des Wirts zu widerstehen. In Boden und Wasser verhindern Kapseln, dass Bakterien von Protozoen verschlungen werden. Kapseln helfen auch vielen Bakterien, an Oberflächen zu haften und widerstehen so der Spülung. Es ermöglicht auch vielen Bakterien, Biofilme zu bilden. Ein Biofilm besteht aus Schichten von Bakterienpopulationen, die an Wirtszellen haften und in eine gemeinsame Kapselmasse eingebettet sind.,
Weitere Informationen zu den Bakterienkapseln finden Sie in den folgenden Lernobjekten in Ihrem Vorlesungsleitfaden:
- Die Glykokalyx (Kapsel) und S-Schicht; Einheit 1, Abschnitt IIB4a
- Die Fähigkeit, phagozytären Engulationen zu widerstehen; Einheit 3, Abschnitt B5b
ORGANISMUS
Magermilchbrühekultur von Enterobacter aerogenes. Die Magermilch liefert essentielle Nährstoffe für die Kapselproduktion und sorgt zudem für einen leicht färbbaren Hintergrund.
VERFAHREN (einzeln durchzuführen)
1., Rühren Sie die Magermilchbrühekultur mit Ihrer Schlaufe auf und legen Sie 2-3 Schlaufen Enterobacter aerogenes auf einen Mikroskopträger.
2. Verteilen Sie die Probe mit Ihrer Impfschleife so, dass sie etwa einen Zoll der Folie abdecken.
3. Lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen. Nicht erhitzen fix. Kapseln haften gut an Glas und Hitze kann die Kapsel zerstören.
4. Fleck mit Kristallviolett für eine Minute.
5. Den überschüssigen Farbstoff mit 20% Kupfersulfatlösung abwaschen.
6. Schütteln Sie die überschüssige Kupfersulfatlösung ab und tupfen Sie sie sofort trocken.
7. Beobachten Sie mit Ölimpulsmikroskopie., Der Organismus und die auf dem Objektträger getrocknete Milch nehmen den violetten Farbstoff auf, während die Kapsel farblos bleibt.
8. Stellen Sie sicher, dass Sie den verwendeten Farbstoff vorsichtig in Ihr Färbefach in den Abfallfarbstoffsammelbehälter gießen, nicht in die Spüle.
9. Beobachten Sie den Demonstrationskapselfleck von Streptococcus lactis , einem eingekapselten Bakterium, das eine normale Flora in der Milch ist.
A. Der Grammfleck
Zeichnen Sie jedes Bakterium auf Ihrem Grammfleckpräparat.,
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| Color = Gram reaction = Shape = |
Color = Gram reaction = Shape = Arrangement = |
B., Der Kapselfleck
Zeichnen Sie Ihre Kapselfleckpräparation von Enterobacter aerogenes und den Demonstrationskapselfleck von Streptococcus pneumoniae.
– Kapsel Fleck der
Streptococcus lactis
