Entdeckung der mitochondrialen DNA
Einige Konzepte erobern die wissenschaftliche Welt im Sturm, andere erobern sie erst nach vielen Scharmützeln. Die Entdeckung von mitochondrialer DNA (mtDNA) gehört zu dieser zweiten Kategorie. Biochemiker, Histologen und Elektronenmikroskopiker hatten jahrelang DNA in Mitochondrien gesehen, aber die meisten von ihnen waren nicht bereit für die Idee, dass die DNA wirklich dorthin gehörte. Dies kann erklären, warum Lehrbuchkonten von mtDNA fast nie sagen, wie diese DNA entdeckt wurde.,
Nachdem der grundlegende Bauplan der eukaryotischen Zelle in den frühen 1950er Jahren durch die Elektronenmikrographen von Palade, Sjöstrand und anderen aufgedeckt worden war, nahmen Biochemiker de Duves Dogma an, dass jedes Makromolekül einen und nur einen intrazellulären Ort hatte. Bei der Analyse von Zellfraktionen wurde Cytochromoxidase als Marker für die Mitochondrien, Nicotianamid–Adenin-Dinukleotidphosphat (NADPH) – Cytochrom-c-Reduktase für das endoplasmatische Retikulum und DNA für den Kern genommen., Angesichts dieser Denkweise ist es leicht zu verstehen, warum das Vorhandensein von DNA in mitochondrialen Fraktionen im Allgemeinen auf eine Kontamination durch Kernfragmente zurückgeführt wurde. Histochemische DNA-Flecken, wie die Feulgen-Reaktion, befleckten auch die Kinetoplasten von Trypanosomen und die „Nebenkern“ von Insektenspermatozoen, aber zu dieser Zeit wurde noch nicht erkannt, dass diese Strukturen tatsächlich ungewöhnliche Mitochondrien waren., Im Zytoplasma amphibischer Oozyten wurden auch massive Mengen extranukleärer DNA nachgewiesen, aber es dauerte viele Jahre, bis klar wurde, dass es sich bei dieser DNA tatsächlich um mtDNA handelte, deren Häufigkeit die enorme Menge an Mitochondrien in diesen großen Zellen widerspiegelte. Auf der fünften Jahrestagung der American Society of Cell Biology in Chicago zeigte Hans Ris 1961 Elektronenmikrographen von Mitochondrien mit Einschlüssen, die den DNA-haltigen Nukleoiden von Bakterien ähneln, und machte den ketzerischen Vorschlag, dass Mitochondrien (und auch Chloroplasten) ihre eigene DNA enthalten., In einem Papier, das im folgenden Jahr erschien, Ris und Walter-S Plaut, weiter dokumentiert und erweitert diese Beobachtungen. Bald darauf bestätigten biochemische und morphologische Beweise mehrerer Gruppen das Vorhandensein von DNA in Chloroplasten.
Die Entdeckung der Chloroplasten-DNA ließ Biochemiker einen neuen Blick auf frühe Erkenntnisse von Margaret Mitchell und Boris Ephrussi werfen, dass bestimmte Mutationen, die die Mitochondrienfunktion in der Schimmelpilzneurospora crassa und der Hefe Saccharomyces cerevisiae beeinflussen, nicht nach Mendels Gesetzen vererbt wurden., Es schien verlockend zu spekulieren, dass die unbekannten „extrachromosomalen Faktoren“, die an diesen Mutationen beteiligt waren, tatsächlich mtDNA waren.
Bis 1962 war der Boden für das Konzept der mtDNA somit gut vorbereitet, aber das Konzept selbst wurde nicht allgemein akzeptiert. Rückblickend scheint die wissenschaftliche Gemeinschaft auf überzeugende Studien zu warten, die die Existenz von mtDNA mit verschiedenen Methoden dokumentierten.
Eine dieser Studien stammte von den Elektronenmikroskopikern Margit MK Nass und Sylvan Nass, die damals am Wenner Gren Institut der Universität Stockholm arbeiteten., Sie zeigten, dass die Matrix der Osmium-fixierten Hühnerembryo-Mitochondrien fadenartige Einschlüsse enthielt, deren Aussehen nach verschiedenen Fixierungsverfahren eng mit dem des histonfreien DNA-Nukleoids von Bakterien übereinstimmte: Nach der Fixierung mit Osmium-Tetroxid erschienen die Einschlüsse verklumpt und als Stäbe mit einem Durchmesser von ~400 Å; Die Fixierung der Gewebe mit Osmium-Tetroxid, gefolgt von der Behandlung mit Uranylacetat vor der Dehydratation, ließ sie als 15-30-Å dünne Fasern erscheinen., Noch überzeugender für das Vorhandensein von DNA in diesen Einschlüssen war die Beobachtung, dass die Einschlüsse durch Behandlung des leicht fixierten embryonalen Gewebes mit DNase entfernt werden konnten. Die Behandlung mit Pepsin, mit RNase oder mit DNase-freien Pufferkontrollen war unwirksam. Die Klarheit dieser Elektronenmikrographen und die sorgfältigen Kontrollen, die einbezogen wurden, hatten einen überzeugenden Einfluss auf Zellbiologen. MMK Nass und S Nass veröffentlichten ihre Arbeit in zwei Back-to-Back-Papieren in einer 1963-Ausgabe des Journal of Cell Biology., Zu dieser Zeit waren Zellbiologie und Biochemie jedoch noch ziemlich unterschiedliche Disziplinen, und die meisten Biochemiker gingen nicht in Zeitschriften ein, die sich der Zellbiologie widmeten. Es dauerte daher eine Weile, bis die Befunde von MMK Nass und S Nass in das Bewusstsein der biochemischen Gemeinschaft gelangten.
Etwa zur gleichen Zeit versuchten Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy und Schatz am Institut für Biochemie der Universität Wien, eine biochemische Grundlage für die extrachromosomalen Mutationen zu finden, die die Atmungsfunktion in der Hefe S. cerevisiae abschafften., In den frühen 1960er Jahren zögerten viele Biochemiker immer noch, das „respiratorische Granulat“ von Hefe als echte Mitochondrien zu betrachten, was die Forschung von Haslbrunner et al. weit außerhalb des Mainstreams der mitochondrialen Biochemie in den USA und anderswo.
Um in Mitochondrien nach DNA zu suchen, wurde ein biochemischer Ansatz gewählt. Hefe-Mitochondrien wurden mit den besten verfügbaren Methoden gereinigt und ihr DNA-Gehalt wurde durch die altehrwürdige „Diesche“ – Farbreaktion gemessen., Einige Jahre zuvor hatten de Duve und Kollegen gezeigt, dass das Zentrifugieren subzellulärer Fraktionen zum Gleichgewicht in einem Dichtegradienten häufig zu einer sauberen Trennung verschiedener Organellen führte. Überraschenderweise trennten die üblichen Saccharose-Gradienten Hefe-Mitochondrien nicht von Kernfragmenten, aber als Saccharose durch das Röntgenkontrastiermittel „Urografin“ ersetzt wurde, bildeten die Mitochondrien ein extrem scharfes Band, und DNA war nur in zwei Fraktionen vorhanden: Die meisten befanden sich am Boden des Zentrifugenröhrchens und eine sehr kleine Menge, aber der Peak stimmte genau mit dem der Mitochondrien überein., Die DNA in der unteren Fraktion wurde leicht durch DNase verdaut und stellte anscheinend Kern-DNA dar. Die DNA in der Mitochondrienfraktion wurde nicht ohne weiteres durch DNase verdaut, es sei denn, die Organellen wurden zuerst mit Trichloressigsäure gestört; vermutlich stellte sie DNA dar, die von den Mitochondrienmembranen eingeschlossen war. Seine Konzentration war zwischen verschiedenen Experimenten sehr konstant – zwischen 1 und 4 µg mg-1 mitochondriales Protein. Urografin-gereinigte Mitochondrien aus Rattenleber, Rattenniere und Rinderherz – enthielt fast 10-mal weniger DNA, zwischen 0,2 und 0,6 µg DNA pro mg Protein., Das typische Säugetier-Mitochondrium wurde berechnet, um 3 × 10-17 g DNA zu enthalten. Unter der Annahme, dass die DNA doppelsträngig war, konnte sie nicht mehr als 1,2 MDa Polypeptidketten kodieren. Dieses Ergebnis wurde als wichtig angesehen, da die Möglichkeit, dass mtDNA alle mitochondrialen Proteine kodiert, fest ausgeschlossen wurde. Heute ist diese frühe Berechnung von Haslbrunner et al. könnte aus mehreren Gründen in Frage gestellt werden, doch kam es bemerkenswert nahe an der Realität: die 13 Polypeptide von Säugetier mtDNA codiert haben eine Gesamtmasse von 0.,423 MDa, und der Rest des Kodierungspotentials wird weitgehend durch Gene für ribosomale und Transfer-RNAs sowie durch die Tatsache erklärt, dass Mitochondrien normalerweise mehr als eine Kopie ihres DNA-Genoms haben.
