Good Mood

Innledning

Neste generasjons sekvensering (NGS) har raskt vokst i klinisk setting i haemato-onkologi og onkologi, som det kan gi store fordeler for diagnose, valg av behandling, og/eller prognostication for mange pasienter (1)., Nylig, flere artikler om validering av dyp målrettet NGS i klinisk onkologi ble publisert (2, 3), inkludert en omfattende anbefaling av Association for Molekylær Patologi og College of American Patologer (1). Men mangelen på standardisering av målrettede NGS metoder fortsatt begrenser deres implementering i klinisk praksis (4).

En utfordring spesielt er riktig påvisning av mutasjoner stede ved lav variant allelet frekvenser (VAF) og standardisering av sekvensering dekning dybde (1, 5, 6)., Dette er spesielt viktig for mutasjoner som har kliniske konsekvenser på subclonal frekvenser (1), for eksempel i tilfelle av TP53-genet mutasjoner (TP53mut) i kronisk lymfatisk leukemi (CLL) (7, 8). TP53 avvik (TP53mut og/eller kromosom 17p sletting) er blant de sterkeste prognostiske og prediktive markører veiledende behandling beslutninger i CLL (9)., I dag, European Research Initiative on Kronisk Lymfatisk Leukemi (ERIC) anbefaler å oppdage TP53mut med en deteksjonsgrense (LOD) på minst 10% VAF (10), og en økende mengde bevis finnes dedikert til den kliniske effekten av små TP53 muterte subclones i CLL (7, 8).

Sanger-sekvensering og dyp målrettet NGS er for tiden de teknikker som er mest brukt for TP53mut analyse (10) samt for analyse av andre gener med kliniske konsekvenser ved lave allelet frekvenser., Selv om Sanger-sekvensering gir en relativt tilgjengelig sekvensering tilnærming, det mangler følsomhet som trengs for å oppdage subclones på grunn av sin deteksjonsgrensen for 10-20% av muterte alleler (10). NGS-basert analyse har dermed fått en fremtredende rolle i diagnostiske laboratorier for påvisning av somatiske varianter og ulike tekniske utviklingen av feilretting strategier, både maskinelt og eksperimentell, er utviklet for nøyaktig identifisering av lav-nivå genetiske varianter (11)., Vi har derfor adresse viktigheten av riktig fastsettelse av sekvensering dybde i diagnostiske NGS for å få en trygg og reproduserbar deteksjon, ikke bare av lave VAF varianter. Til slutt, har vi utført en fortynning eksperiment for å bekrefte våre teoretiske beregninger, og vi avslutter med å snakke om vår erfaring med diagnostikk påvisning av TP53mut i CLL pasienter og videre perspektiver om NGS standardisering av kreft diagnose.,

NGS Sekvensering Dybde og Feil Pris

NGS sekvensering dybde direkte påvirker reproduserbarheten av variant deteksjon: jo høyere antall justert sekvens leser, jo høyere tillit til base-anrop til en bestemt stilling, uavhengig av om base samtalen er den samme som referanse base eller er mutert (1). Med andre ord, individuelle sekvensering feil leser er statistisk irrelevant når de er i mindretall av riktig leser., Dermed ønsket dekning dybde bør fastsettes basert på beregnet LOD, toleranse for falske positive eller falske negative resultater, og feil i pris på sekvensering (1, 11).

ved Hjelp av en binominal distribusjon, sannsynligheten for falske positive og falske negative resultater for en gitt feil pris, så vel som hadde til hensikt å LOD kan beregnes, og terskelen for en variant ringer for en gitt dybde kan være estimert (1)., For eksempel, gitt en sekvensering error rate på 1%, en mutant allel byrden av 10%, og en dybde på dekning 250 leser, sannsynligheten for å oppdage 9 eller færre muterte leser er, i henhold til binominal distribusjon, 0.01%. Derfor er sannsynligheten for å oppdage 10 eller mer muterte leser er 99.99% (100-0.01%), og terskelen for en variant som ringer kan være definert. Med andre ord, en dekning dybde på 250 med en grense på minst 10 muterte leser vil ha en 99.,99% sannsynlighet for at 10% av mutant allel legg vil ikke bli savnet av variant ringer til (selv om det kan bli oppdaget i en annen del). På denne måten er risikoen for falske negative resultat er sterkt minimert. På den annen side, er sannsynligheten for falske positiver sterkt avhengig av sekvensering error rate (som nøyaktigheten av alle analytiske målinger avhenger av signal-til-støy-forhold) (1, 11). I vårt eksempel, er sannsynligheten for et falskt positivt resultat, er 0.025%, men frekvensen av falske positiver er ikke ubetydelig når avtagende LOD til verdi nær til feil pris., Konvensjonelle iboende NGS feil priser varierer mellom 0,1 og 1% (Phred kvalitet score på 20-30) (1, 11), avhengig av sekvensering plattform, GC-innhold av målet regioner (12), og fragment lengde, som vist i Illumina sammenkoblede-end-sekvensering (13). Derfor, påvisning av varianter på VAFs <2% er påvirket av en høy risiko for et falskt positivt resultat, uavhengig av dekning dybde., Det er også viktig å nevne at sekvensering feil pris gjelder kun for feil som produseres av sekvensering seg selv, og omfatter ikke andre feil introdusert i løpet av DNA-behandling og-biblioteket i forberedelser, spesielt under amplifikasjonstrinnene, noe som ytterligere øker feil priser (1, 11).

Minimum Sekvensering Dekning i Klinisk Innstillinger

Det er for øyeblikket ingen konsensus på minimum som kreves dekning i en klinisk setting ved hjelp av dype målrettet resequencing av NGS, og slik at hvert laboratorium har til å sette sine egne parametere for å møte tilstrekkelig kvalitet (1, 5)., Til dags dato, bare noen få studier har anbefalt minimum dekning kriterier for dyp målrettet NGS i klinisk onkologi: 500 dybde av dekning og en LOD av 5% (2), 300-500 dybde av dekning uten trosset LOD (3), 250 dybde og en LOD på 5% med terskel justering 1000 dybde av dekning er nødvendig i tilfeller av heterogene varianter i lave svulst cellularity prøver (1), og 100 dybde med minst 10 variant lyder og en LOD av 10% (10)., I henhold til binominal-data distribusjon, en dekning dybde på 250 bør faktisk være tilstrekkelig til å oppdage 5% VAF med en terskel av variant støtte leser ≥5 (Figur 1). På den annen side, NGS analyse med en dekning dybde av 100 sammen med et krav om minst 10 variant støtte lyder som er anbefalt av ERIC consortium (10) ville føre til et falskt negativt på 45% for prøver med LOD av 10%., For å bekrefte disse teoretisk beregninger, har vi utført to uavhengige fortynning eksperimenter for å beregne ytelse av TP53 NGS-analyse for å oppdage 10% VAF på en dybde av dekning av 100 leser. Ja, vi har oppdaget 30% av falske negativer (5 positive prøver av 7 sant-positive prøver og 9 positive prøver av 13 sant-positive prøver) i to uavhengige sekvensering går. Dessverre, den falske negative pris er ofte undervurdert i målrettet resequencing., Også, en fersk studie som undersøker inter-laboratorium resultatene av somatiske variant deteksjon med VAFs mellom 15 og 50% i 111 laboratorier med rapportert LODs på 5-15% (6) viser at store feil i diagnostiske NGS kan oppstå fra falske negative resultater, også i prøver med høy mutasjon laster (6). Tre samtidige falske positive resultater, alle varianter ble oppdaget på riktig måte, men mischaracterised (6)., Siden laboratorier har ikke blitt bedt om å rapportere dekning dybde for andre regioner enn de identifiserte varianter (6), kan vi bare anta at lav dekning eller høy variant ringer terskler bidratt til falske negative resultater. Disse resultatene ytterligere behovet for standardiserte dekning dybde parametere i diagnostiske NGS, som tar hensyn til sekvensering feil så vel som analyse-spesifikke feil.

Frekvens av TP53 Subclonal Mutasjoner i CLL Oppdaget Gjennom Diagnostiske NGS

for å vurdere forekomsten av lav VAF i den virkelige verden innstillinger, vi gjennomgått vår kohort av CLL pasienter undersøkt for TP53mut i vår diagnostisk laboratorium. Den TP53mut ble vurdert som rapportert tidligere (14, 15). Kort, TP53 (exons 2-10 inkludert 2 bp intronic overlapper, 5′ – og 3’UTR) ble analysert ved hjelp av 100 ng gDNA per reaksjon., Amplikon-basert bibliotek ble sekvensert som paret,-slutten på MiSeq (2×151, Illumina) med minimum målet les dypet av 5000 x. LOD av TP53mut ble satt opp til 1%, og varianter i størrelsesorden 1-3% ble bekreftet ved replikasjon. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som ble registrert i samsvar med Helsinki-Deklarasjonen, og studien ble godkjent av den lokale etiske komité.

Av diagnostiske kohort av 859 CLL pasienter (April 2016–April 2019), 25% (215/859) var positive for TP53mut, og av disse, 52.6% (113/215) gjennomført varianter med VAF på 10% eller lavere., I tråd med våre observasjoner, en fersk studie (8) rapporterte forekomsten av 63 og 84% lav belastning (Sanger negative) TP53muts i CLL pasienter på tidspunktet for diagnose og behandling, henholdsvis, og bekreftet negativ innvirkning på den generelle overlevelsen av TP53muts over 1% VAF på tidspunktet for behandlingen (8).,

Kalkulator for Diagnostisk NGS Innstillinger for Påvisning av Subclonal Mutasjoner

for Å hjelpe laboratorier med fastsettelse av minimum riktig dekning parametre, vi er å gi en enkel, brukervennlig teoretiske kalkulator (programvare) basert på den binomiske fordelingen (Figur 2), som beskrevet i Utfyllende Fil. En web (eller desktop) søknad og frittstående kildekode-koder i R er tilgjengelig på Github: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Ved hjelp av denne kalkulatoren, den riktige parametere av sekvensering dybde og tilsvarende minimum antall variant leser for en gitt sekvensering feil og hadde til hensikt å LOD kan lett bli bestemt. Videre kan brukerne også ta hensyn til andre feil ved ganske enkelt å legge til analyse-spesifikke feil til sekvensering feil pris på og bruke denne generelle feil som en inngang til kalkulator. For eksempel, i vårt tilfelle av TP53 mutational analyse vi beregnet samlet sett feil på ~1.16%, og dermed setter vi opp vårt minimum dekning dybde krav til 2000 med terskel på minimum 40 leser for 3% VAF.,

Diskusjon

Selv om diagnostiske NGS har fått en fremtredende rolle i klinisk innstillinger for vurdering av somatiske mutasjoner i kreft, manglende standardisering av sekvensering parametere fortsatt begrenser dens implementering i klinisk praksis (1), hovedsakelig for varianter til stede ved lave allelet frekvenser (4). Vi, derfor, adressert tekniske spørsmål for å fastslå den sekvensering dybde i diagnostiske NGS for å få trygg og reproduserbar påvisning av lavt VAF varianter., I særdeleshet, har vi utført teoretiske beregninger for å bestemme optimal dybde dekning for ønsket sannsynligheten for deteksjon av varianter med lave allelet frekvenser, tar hensyn til sekvensering feil pris. Dessuten, vi bekreftet disse teoretiske beregninger ved å gjennomføre fortynning eksperimenter. Basert på disse observasjonene, anbefaler vi en dybde på dekning av 1,650 eller høyere (sammen med de respektive terskel på minst 30 muterte leser) for å ringe ≥3% varianter for å oppnå en 99,9% sannsynlighet for variant deteksjon, ved hjelp av konvensjonelle NGS sekvensering bare feil., Varianter i 1-3% VAF utvalg kan kun bli kalt hvis fått sekvens dataene er av høy kvalitet (gjennomsnittlig 30 > 90%) og/eller når de variantene er bekreftet av replikering eller ortogonale metode (1, 11, 16). Vi er også å gi en enkel, brukervennlig teoretiske kalkulator (programvare) for å bidra til laboratorier med å løse den riktig sekvensering dybde og tilsvarende minimum antall variant lyder mens du tar hensyn til sekvensering feil pris. Vår enkel kalkulator kan hjelpe til med å minimere falskt positive og falskt negative resultater i diagnostiske NGS.,

Likevel, riktig sekvensering dybde er også påvirket av analysen-spesifikke faktorer (1). Målefeil kan oppstå på mange stadier i løpet av DNA-behandling og bibliotek forberedelse. De mest vanlige er forsterkning feil introdusert i løpet NGS bibliotek forberedelse (1, 12, 17). Andre vanlige kilder til feil har å gjøre med biblioteket kompleksitet (antall uavhengige DNA-molekyler analysert), DNA-kvalitet, og målet regionen kompleksitet osv. Alle potensielle analyse-spesifikke feil som bør tas opp gjennom test design, metode for validering og kvalitetskontroll.,

i Dag, dukker opp error correction strategier, både maskinelt og eksperimentell, er utviklet for å redusere den høye feil priser i diagnostiske NGS (11). Så langt er blant de mest lovende error correction metoder er UMI (Unike Molekylære Identifikatorer), som er riktig for PCR-feil (18), og signal-til-støy-korreksjon tilnærminger (11). Disse fremskritt forsøk på å redusere LOD, og dermed øke sekvensering nøyaktighet som er nødvendig for fremtidige muligheter i NGS diagnose.,

for å forbedre standardisering i diagnostiske NGS, estimering av riktig dekning dybde er en anbefalt utgangspunkt ved vurderingen av terskler rundt en bestemt NGS-analysen. Likevel, det er fremdeles mangel på publiserte veiledning om minimum tekniske krav og sin rapportering i NGS, spesielt viktig i påvisning av clonal og subclonal mutasjoner i kreft diagnose., Dette er hovedsakelig på grunn av det brede spekter av biblioteket forberedelse tilnærminger, og mange variabler som spiller en rolle i hver enkelt NGS-analysen, som er vanskelig å standardisere, sammen med inter-laboratorium variasjon. Derfor definisjonen av minimum tekniske krav og sin rapportering i NGS er svært ønskelig., Basert på vår erfaring i diagnostiske NGS i haemato-onkologi, foreslår vi å rapportere minst følgende tekniske parametere: LOD, totalt feil av NGS-analysen (eller i det minste sekvensering feil pris), mengden av DNA-inngang, kilde, og kvaliteten på DNA, minimum dekning dybde og andelen av målrettede baser sekvensert på dette minimum dybde, totalt antall mål-leser som dekker variant region og antall lesninger som støtter variant. Spesiell vekt bør gis til NGS standardisering av formalin-fast parafin (FFPE -) prøver (19, 20).,

Tatt sammen, og vår studie understreker betydningen av riktig sekvensering og dybde minimum antall lesninger er nødvendig for å få pålitelige og reproduserbare påvisning av varianter med lave VAF i diagnostiske NGS. Beregning av riktig sekvensering dybde for en gitt feil ved hjelp av vårt brukervennlige teoretiske kalkulator (programvare) kan bidra til å minimere falskt positive og falskt negative resultater i diagnostiske NGS, i situasjoner knyttet til subclonal mutasjoner blant andre., Den grundige tester og standardisert minimum krav til diagnostisk NGS er særlig ønskelig for å sikre korrekte resultater i kliniske settinger.

Data

datasett generert for denne studien er tilgjengelig på rimelig forespørsel til korresponderende forfatter.

Forfatter Bidrag

AP og EK designet for studien, tolket resultatene, og skrev manus. AP, LS, TD, og PS utført NGS analyse. TP samlet pasienten prøver og kliniske data. MV utført bioinformatikk analyse og skrev kalkulator kode. TN forberedt web-applikasjon., Alle forfattere lest og godkjent den endelige versjonen av manuskriptet.

Midler

Gi støtte: MZ CR VES16-32339A, i en del av MH CZ—DRO (FNOl, 00098892).

interessekonflikt Uttalelse

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller finansielle forhold som kan oppfattes som en potensiell interessekonflikt.

Erkjennelsene

Vi beklager til de mange forfattere som artikler kunne ikke bli sitert på grunn av referanse grenser.,

Supplementary Material