Good Mood

Resultater og Diskusjon

Arabidopsis cDNA bibliotek ble vist ved hjelp av 35S-merket CaM-bindende screening tilnærming som beskrevet (24). En av de positive klonene viste et identisk nukleotid-sekvensen til AtCat3 i databasen (GenBank tiltres ikke. U43147). For å bevise at AtCat3 kodet en CaM-bindende protein, full koding regionen AtCat3 var subcloned i pET14b uttrykk vektor. Den rekombinant AtCat3 var forårsaket av isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG) (Fig., 1A) og ble renset ved CaM affinitet kromatografi til i nærheten av homogenitet. Totalt bakteriell ekstrakt ble brukt til CaM-bindende analysen, og det ble vist at 35S-merket CaM binder seg til AtCat3 protein i nærvær av Ca2+ (Fig. 1A). Etter å ha lagt EGTA, ingen CaM bindende ble observert. Videre 35S-merket CaM gjorde ikke binde seg til AtCat3 når CaCl2 ble erstattet av andre divalent kationer som MgCl2 eller MnCl2 (Fig. 1A), noe som tyder på at CaM binding til AtCat3 er Ca2+-avhengige.

for Å identifisere CaM-bindende området i AtCat3, to C-terminal sletting mutanter ble brukt for 35S-CaM-bindende analyser. I nærvær av 0.,2 mM Ca2+, CaM binder seg til wild-type og mutant 1-451, mens CaM gjorde ikke binde seg til mutant 1-414 (Fig. 1B), noe som tyder på at CaM-bindende regionen for AtCat3 er begrenset til aminosyrer 415-451. For å ytterligere bekrefte CaM binding til AtCat3, et syntetisk peptid tilsvarende aminosyrer 415-451 av AtCat3 ble inkubert med CaM. Dannelsen av peptid-CaM komplekset ble vurdert av nondenaturing SIDE. Den 36-mer peptid er i stand til å danne et stabilt kompleks med CaM i nærvær av Ca2+ (Fig. 1C). I fravær av peptid, en singel CaM bandet ble observert., Som peptid økt konsentrasjon, et band med lav mobilitet dukket opp, som representerer peptid-CaM komplekse. Når molar forholdet mellom peptid og CaM var 1:1, bare peptid-CaM komplekse bandet ble oppdaget, noe som indikerer at det er bare en CaM-bindende nettstedet i peptid. Ingen peptid-CaM komplekset ble dannet i nærvær av EGTA (Fig. 1C). Disse resultatene indikerer at CaM spesifikt binder seg til AtCat3 i en kalsium-avhengig måte.

Catalase som finnes i nesten alle aerobe organismer. I dyr, det er bare en catalase isoformen kodet av et enkelt gen., I kontrast, catalase i planter er til stede som flere isoforms kodet av en liten genet familie (6, 26). Minst dette er sant i monocots for eksempel mais og dicots som tobakk, Arabidopsis, og gresskar, som catalase er godt karakterisert. Det er interessant at hver av dem har tre isoforms kodet av tre gener. For å finne ut om alle catalases har CaM-bindende regioner, aminosyre-sekvensen av 37 catalases fra bakterier, dyr og planter ble sammenlignet ved hjelp av pileup programmet i GCG10 pakken., Aminosyresekvens sammenligningen åpenbart svært høy homologi i N-terminal 384 aa (ca 60% likhet og 50% identitet). Imidlertid, i C-terminal 108 aa, hvor CaM-bindende regionen er plassert, det var svært lite sammenfall mellom AtCat3 og andre nonplant catalases (ca 21% homologi og 14% identitet). Likevel, alle anlegg catalases viste høy homologi i denne delen (ca 78% homologi og 70% identitet), spesielt i regionen tilsvarende til CaM-bindende området i AtCat3. Fig. 2 viser C-terminal 108-aa-sekvens sammenligning av 13 representant catalases., Selv om aminosyren sekvenser i preget CaM-bindende proteiner er ikke bevart i CaM-bindende regionen, de fleste av dem har en sekundær strukturell funksjon, grunnleggende amfifile α-helix (27), som auxin-regulert protein ZmSAUR1 (24) og plante chimeric Ca2+/CaM protein kinase (28). Merk at det er ofte negativt ladet aminosyrer i CaM-bindende regioner, men netto kostnad er positive (16). Basert på den spiralformede hjulet projeksjon bruke GCG program, det ble bestemt at aminosyrer 438-451 i AtCat3 er i stand til å danne en grunnleggende amfifile α-helix., Det er klart at den ene siden av spiralformede hjulet er hydrofobe og den andre siden er hydrofile, med netto positive ladninger. Analyse av aminosyren sekvenser tilsvarende til CaM-bindende regionen AtCat3 forutså eksistensen av en grunnleggende amfifile α-helix i noen av andre anlegg catalases. Interessant, blant tre catalase isoforms i mais, tobakk, Arabidopsis, og gresskar, det er minst en isoformen med amfifile α-helical strukturen i hver arter, f.eks.,, tobacco1 (aminosyrer 431-444), maize3 (aminosyrer 442-455), og pumpkin1 (aminosyrer 438-451), samt Arabidopsis AtCat1 (aminosyrer 438-451). Om den er sann for alle plantearter er ikke klart på grunn av begrenset catalase sekvenser for andre plantearter i GenBank. Basert på krystall struktur data på bakteriell og pattedyr catalases, α-helices er den typiske strukturer i C-terminal del av disse catalases (29), men ingen grunnleggende amfifile α-helical struktur finnes i denne delen, i henhold til spiralformet hjulet projeksjon.,

for Å teste om CaM binder seg til renset catalase fra planta, tobakk catalase ble renset fra bladene basert på Durner og Klessig (10). En CaM-Sepharose kolonnen ble brukt som siste trinn i en renselsesprosess. Oppsummering av rensing trinn av catalase bruke 1,000 g av tobakk bladene er presentert i Tabell 1. Tobakk catalase ble renset til i nærheten av homogenitet som bedømmes av SDS/SIDE og sølv farging (Fig. 3, lane 1). Catalase identiteten ble bekreftet av Western blotting med en mAb mot tobakk catalase (Fig. 3, lane 3)., CaM binding til renset tobakk catalase ble demonstrert av følgende tilnærminger. (i) En CaM-Sepharose kolonnen ble brukt til rensing av tobakk catalase. Utvinningsgraden for dette trinnet var 81% (Tabell 1), noe som tyder mest av catalase fra tobakk blader er en CaM-bindende protein. (ii) 35S-merket CaM ble brukt til å teste den bindende for de rensede catalase i nærvær av 0,2 mM CaCl2 (Fig. 3, lane 5). Rekombinant AtCat3 ble brukt som en kontroll (Fig. 3, kjørefelt 2, 4 og 6). Tillegg av 0.,4 mM EGTA avskaffet CaM bindende, noe som tyder på at CaM binder seg til anlegget catalase i en Ca2+-avhengig måte. CaM-bindende analysene ble også gjennomført for å finne ut om det binder seg til sopp, storfe, eller menneskelig catalase. Resultatene viste at ingen av disse nonplant catalases viste noen CaM bindende (data ikke vist), som er i overensstemmelse med aminosyresekvens sammenligninger (Fig. 2).,

CaM-bindende nettstedet eller tett sidestilt regioner i andre preget CaM-bindende proteiner ofte fungerer som autoinhibitory eller pseudosubstrate domener. Denne regionen opprettholder målet proteiner i en inaktiv tilstand i fravær av Ca2+ – signal, for eksempel i anlegget chimeric Ca2+/CaM-avhengig protein kinase (30) og glutamat decarboxylase (31). For å studere betydningen av CaM binding til anlegget catalases, katalytisk aktiviteter av rekombinant AtCat3 og renset tobakk catalase ble målt i nærvær og fravær av CaCl2 og CaM., Tilsvarende eksperimenter også ble utført ved hjelp av andre nonplant catalases. E. coli-uttrykt rekombinant AtCat3 viste ingen aktivitet. Lignende resultater ble oppnådd i et annet laboratorium (Zhixiang Chen, personlig kommunikasjon). Dette kan ha resultert fra manglende evne til å danne riktig struktur for rekombinant catalase, fordi det aktive catalase er en tetramer består av fire identiske eller lignende underenhetene (6, 10, 26). I kontrast, den rensede tobakk catalase viste en betydelig Ca2+/CaM-avhengige endring i aktivitet under rensing trinn (Tabell 1)., Den stimulerende effekten av Ca2+/CaM er ca 2.2-brett på hvert trinn, med unntak av prøven som ble oppnådd etter CaM-Sepharose kromatografi. Det viste en høyere stimulering av catalase aktivitet (2.5-fold) muligens på grunn av fjerning av ikke-Ca2+/CaM-bindende catalase brøkdel (Tabell 1). Den ikke-Ca2+/CaM-bindende catalase brøkdel hadde en spesifikk aktivitet av 59.6 enheter (basal aktivitet). Imidlertid, Ca2+/CaM ikke stimulere aktiviteten av dette brøkdel av catalase (data ikke vist)., Disse resultatene indikerer at Ca2+/CaM er i stand til å aktivere tobakk catalase i den fraksjonen som ble oppnådd etter CaM-Sepharose kromatografi, som tilsvarer CaM-bindende resultater. For å sammenligne virkninger av Ca2+/CaM på aktivitet catalases fra ulike kilder, den relative aktiviteten ble brukt, fordi det er betydelig forskjell i spesifikk aktivitet av catalases fra ulike arter. For eksempel, A. niger catalase har bestemt aktivitet på 5,7 enheter: bovine liver catalase, 51.9 enheter; menneskelig erytrocytter, 39.5 enheter; tobakk catalase, 63.,1-enheter (i fravær av Ca2+/CaM). Fig. 4A viser at CaCl2 alene eller CaM alene hadde ingen stimulerende effekt på tobakk catalase aktivitet (om lag 40% av maksimal aktivitet). Ingen forskjell i katalytisk aktivitet ble observert i sopp, storfe, eller menneskelig catalases i nærvær eller fravær av Ca2+, CaM, og Ca2+/CaM (Fig. 4A). Ved å bytte ut CaCl2 med MgCl2, det var ingen signifikant endring i tobakk catalase aktivitet i nærvær eller fravær av CaM (data ikke vist)., For ytterligere å dokumentere effekten av Ca2+/CaM på anlegget catalase aktivitet, 10 µM av peptid tilsvarende AtCat3 CaM-bindende regionen (415-451) ble lagt til i hver reaksjon blandingen. Nonplant catalases var upåvirket av tillegg av peptid. Imidlertid, den stimulerende effekten av Ca2+/CaM på tobakk catalase aktivitet ble avskaffet ved tillegg av peptid (Fig. 4A). I tillegg, den hemmende effekten av peptid på tobakk catalase aktivitet er avhengig av konsentrasjonen av peptid (Fig. 4B)., Den catalase aktivitet ble hemmet av om lag 58%, som er nær basal aktivitet av catalase. Imidlertid, peptid hadde ingen effekt på storfe catalase aktivitet på alle konsentrasjonene som ble testet (Fig. 4A). Disse resultatene tyder på at Ca2+/CaM har en stimulerende effekt på renset anlegg catalase, men har ingen effekt på nonplant catalases.

Det er kjent at catalase er en dominerende peroxisomal enzymet, men det finnes også i mitokondrier og cytoplasma (32). For eksempel, mais Cat3, noe som kan være en CaM-bindende catalase basert på aminosyresekvens sammenligningen, er en mitokondrie protein (33). Våre resultater (Fig. 1-4) viser at CaM binder seg til å plante catalase og regulerer sin virksomhet. For å vise tilstedeværelsen av denne regulatoriske aktivitet in vivo, vi undersøkt hvorvidt CaM coexists med catalase i peroxisomes av planter., Dannes fra etiolated gresskar cotyledon ekstrakter ble separert av sukrose tetthet sentrifugering. For å fjerne forurensning av cytosolic proteiner som kan være til stede i løsningen eller bare forbundet med peroxisomal membran, den isolerte peroxisomes ble behandlet med proteinase K. På denne måten, peroxisomal proteiner skjermet fra protease av peroxisomal membran var ikke fordøyd (34, 35). Identiteten til den peroxisomal fraksjoner ble bevist ved å måle catalase aktivitet (35)., CaM er veldig bevart over kongeriker (13-16), derfor er vi gjorde Western analyse med en anti-human CaM-antistoff. Som en kontroll, rekombinant potet CaM PCM6 ble brukt (Fig. 5, lane 3). Det er interessant at et band i en størrelse lik PCM6 var til stede i peroxisomal fraksjoner, men intensiteten var betydelig lavere i forhold til cytosolic CaM (Fig. 5). Disse resultatene indikerer at CaM og catalase er colocalized i peroxisomes. CaM er et lite sure protein som er først og fremst uttrykt i cytoplasma., Imidlertid, i planter, CaM har vist seg å være til stede i flere organeller som kjernen og chloroplasts (36, 37) og ekstracellulære matrix (38). Også, CaM-regulert proteiner finnes i ekstracellulære matrix, kjernen, og chloroplasts (38-40). Hvordan CaM krysser membranen er ikke klart. Nyere studier tyder på at posttranslational endringer spille en rolle i translocation av noen CaM isoforms. For eksempel, en petunia CaM-som protein, CaM53, er forbundet med plasma membran når proteinet er prenylated. Hvis prenylation er hemmet, CaM53 er hovedsakelig funnet i kjernen (41).,

basert på vår nåværende kunnskap, finnes det ingen rapport som drøfter kalsium-konsentrasjon i peroxisomes., Basert på en nylig modifisert modell av peroxisome biogenese, den peroxisome stammer fra endoplasmic reticulum (ER) ved hjelp av preperoxisomal blemmer (42). Det er kjent at er en av de intracellulære kalsium bassenger. Dermed, kalsiumkonsentrasjonen i peroxisomes kan være så høy som i det ER. Måling av peroxisomal kalsium konsentrasjon og for å overvåke hvilken som helst kobling mellom endringen av kalsium-konsentrasjon i cytoplasma og peroxisome bør hjelper i vår forståelse av hvordan peroxisomal catalase reguleres av Ca2+/CaM., For eksempel, den frie kalsium konsentrasjon kunne måles i den transgene planter med rekonstituert aequorin med en peroxisome-targeting-signal. Aequorin er en kalsium-sensitive selvlysende protein, den verdien som direkte rapporter kalsium endre (43). Fordi peroxisome er en stor organell som fjerner giftige ROS, hovedsakelig H2O2, er det rimelig å spekulere i at peroxisomal catalase aktiviteten fortsatt høy hele tiden å degradere H2O2 in situ i et hurtig tempo. Imidlertid, svingninger i cytosolic kalsium kan ha en stor effekt på cytosolic catalase aktivitet., Det er viktig å understreke at ikke alle catalases er CaM-bindende proteiner. Derfor, ytterligere undersøkelser er nødvendig for å løse betydningen av Ca2+/CaM i å kontrollere catalase aktivitet i ulike organeller.

Biotiske og abiotiske stressfaktorer utløse en Ca2+ strøm, og den økte cytosolic Ca2+ stimulerer produksjonen av H2O2, som diffunderer inn i omkringliggende celler som budbringer og induserer fysiologisk respons (19, 20). Våre resultater tyder på at økt cytosolic Ca2+ kan redusere H2O2 nivåer ved hjelp av Ca2+/CaM-mediert stimulering av catalase aktivitet (Fig. 4)., Vi foreslår at økt cytosolic Ca2+ har to roller i regulering av H2O2 homeostase (Fig. 6): (i) positiv regulering genererer H2O2 ved direkte å aktivere NADPH oksidase, som har affinitet til Ca2+ (22) og indirekte å produsere mer NADPH ved hjelp av Ca2+/CaM-regulert NAD kinase (23); og (ii) negativ regulering reduserer H2O2 ved å stimulere catalase aktivitet gjennom Ca2+/CaM modulation (Fig. 4)., Signal-induserte endringer i Ca2+ transienter kan variere i hyppighet, varighet, størrelse og geografisk lokalisering av svingninger, og modus for romlig utbredelse, noe som fører til forskjellsbehandling virkninger på kalsium mål proteiner (12, 44).