Good Mood

Resultater

Ubehandlet Prøver. Spesielt, ser vi at selv i unstained prøver, forskjellene mellom vann og olje dråper (Fig. 1 B og C ) eller mellom ulike bestanddeler i cellen (Fig. 1D ) generere tilstrekkelig kontrast for å skille dem. I cellene, høyere-Z materialer som salter, fosfor og jern, som kan være konsentrert i ulike regioner, som har en tendens til å øke kontrasten. Fig., 1D viser en ubehandlet Chinese hamster ovary (CHO) celle i normal kultur medium ved romtemperatur. Cellen skissere og kjernen med sine interne strukturen er godt synlig, som er en serie av mørke, sfæriske partikler i cytoplasma. Identifisering av disse partikler som kalles lipid-dråpene er diskutert nedenfor.

Heavy Metal-Farging. Grensene på oppløsning og kontrast når observere lavt-Z materiale tyder på at betydelige fordeler kan oppnås ved farging av celler med høy Z markører som elektron-tett flekker eller nanopartikkel gull etiketter., Ja, vi er i stand til å oppdage gull perler i vann ned til en diameter på 10 nm ved hjelp av ultrathin membraner (data ikke vist).

Differensial farging av organeller inne i cellene ved hjelp av electrondense materialer er en standard i EM teknikk, men vanligvis ikke brukes for SEM. Fig. 2 viser et rikt utvalg av strukturer inne i celler dyrket i kultur som var vokst direkte på partisjonen membran og deretter fiksert og farget med uranyl acetat (8). Intracellulære organeller er klart synlig, inkludert interne detaljer av mitokondrier (Fig. 2C ), actin stress fibre (Fig., 2D ), og komplekse rørformet og cytoskeletal strukturer (Fig. 2 A og B ). Den høyere bredde energi i Fig. 2C-prober interne struktur, mens det på lavere energi (Fig. 2D ), overflaten nær membranen er visualisert. Dermed ulike energier kan brukes til å få tak i tre-dimensjonal informasjon.

Nanopartikkel Gull Markører. Høy oppløsning og spesifisitet for deteksjon kan oppnås ved binding av antistoffer eller andre ligander., Som med andre EM-metoder, merking gjøres mest praktisk ved hjelp av gull nanopartikler. I kontrast med overføring EM (TEM), som prøver bare veldig tynn og ofte vilkårlig seksjoner, våt SEM gir en rask veksling mellom lokal og global oversikt over merking av alle over cellen. Fig. 3 A og B viser hvordan 40-nm nanopartikkel gull-merket monoklonale antiepidermal vekstfaktor reseptor antistoffer ble brukt for merking av epidermal vekstfaktor-reseptorer på intakt A431 kreft celler., Fiksering er ofte nyttig og praktisk selv i våt SEM og kan legge til rette merking samt overføring til mikroskop. Cellene som presenteres her er også farget med uranyl acetat, som tillater justering av merket reseptorer med den generelle strukturen i cellene. Høy kontrast og enhetlig størrelse av nanopartikler muliggjør entydig identifisering og lokalisering. Å vite den nøyaktige lokalisering av enkelt-reseptor molekyler åpner muligheten for å måle slike hendelser som epidermal growth factor-indusert reseptor dimerization., Farging av celler er ikke behov for merking, og vi har inkludert et bilde av unstained, merket celler (Fig. 7, som er publisert som støtter informasjon på PNAS web-område). Også vist er et bilde som viser at merking av delene inne i cellen er mulig (Fig. 8, som er publisert som støtter informasjon på PNAS web-området), i dette tilfellet, merking av mitokondrier med gull perler. Merking av actin filamenter innsiden av cellene har også vært oppnådd ved hjelp av subnanometer gull partikler, etterfulgt av sølv ekstrautstyr (data ikke vist).

Et eksempel på gold merking på bakterier er gitt i Fig. 3C . Her, den antatte gastrin reseptor av Helicobacter pylori (9) er oppdaget av inkubasjon med komplekser av biotinylert gastrin og streptavidin-belagt 20-nm gull nanopartikler. Forvalte biotinylert gastrin før den streptavidin-belagt gull gitt nesten ingen vedlegg av nanopartikler til bakterien. Dette resultatet ble oppnådd, uavhengig av tiden mellom to trinn, noe som tyder på at opptaket av gastrin i H. pylori er nesten umiddelbar., Det faktum at complexed gastrin kom ikke inn i cellene poeng til muligheten for å definere grensene for størrelse av partikler som kan være internalisert av bakterier.

Sammenligning av Imaging Teknikker (Trypanosoma brucei). Det er nyttig å sammenligne dette med eksisterende teknologi imaging teknikker ved hjelp av en enkel modell system. En slik studie er beskrevet i Fig. 4, ved hjelp av parasitten T. brucei procyclic form som forplanter i midttarmen av tsetse fly. De tre første bildene viser eksisterende modus bildebehandling: optisk fluorescens mikroskopi (Fig., 4A ), differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi (Fig. 4B ), og O (Fig. 4C ). Styrken av eksisterende teknikker er tydelig: lokalisert merking i fluorescens og detaljerte inndelinger i TEM. De ubehandlede optisk (Fig. 4B ) og våt-SEM (Fig. 4D ) bilder avgrense den grenser i cellen, men er lave i kontrast og mangler detaljer. Begge legger vekt på kjernen, men andre organeller som vises i differensial forstyrrelser kontrast bildet er ikke klart identifisert, mens den våte-SEM-bilde bringer ut lipid-dråper til en fordel. Osmium tetroxide farging (Fig., 4E ) er ikke så nyttig i dette systemet, med vekt på det meste lipid dråper og noen uidentifiserte indre organeller. Den sterkeste imaging er sett i Fig. 4F , som uranyl acetate farging ble brukt. Fordelen med intakt bildebehandling med full celle kan sees (sammen med sin fine interne strukturer som kan observeres i detalj) er tydelig, spesielt i forhold til TEM imaging (Fig. 4C ). Til slutt, våt-SEM avbildning av hel-celle-spesifikk merking med antistoffer mot den store glykosylfosfatidylinositol-forankret overflate strøk protein EP procyclin (10) er vist i Fig., 4 G og H . Interessant, EP procyclin er kjent for å dekke hele cellen jevnt, men det observert signal er gruppert. Vi tilskrive dette til tendensen til at den underliggende lipid flåter til å klynge under påvirkning av antistoffer, en prosess som fiksering i formaldehyd er i stand til å hindre. Gull markører også belyse de tre-dimensjonale konformasjon av cellen på en måte som minner om hvilken standard SEM kan bildet (som er et utmerket, representant SEM-bilde av T. brucei kan bli funnet på http://tryps.rockefeller.edu/crosslab_intro.html).

Selvfølgelig, TEM vil ha bedre oppløsning, generelt, enn våt SEM, men de bildene som presenteres i eksemplet T. brucei for sammenligningen er «typisk» bilder som er innhentet i samme laboratorium., Fordi vått SEM er forskjellige i sin nytteverdi enn TEM og optisk mikroskopi, i T. brucei det kan bli sett på som en viktig supplerende funksjon, og en kan forvente at hele bildet ville bli gitt av en kombinasjon av optisk, TEM, og wet-SEM teknikk.

vevsprøver. Våt SEM kan brukes for tykk prøver som for eksempel vev fragmenter ved ganske enkelt å montere prøven mot membranen. Begrenset prøvetaking dybde av BSEs lar avbildning av en «virtuell delen,» som strekker seg fra overflaten til et definert dybde på opp til et par micrometers uten behov for tynn snitting.,

Fig. 5 A og B viser direkte visualisering av ubehandlet vev fra mus. Fig. 5A er en liten forstørrelse bilde av hjertestans vev. Organiseringen av muskelceller er tydelig. Zoome inn én celle (Fig. 5B ) gir en levende visning av kjernen og intracellulære organeller, muligens mitokondrier, og deres spredning i cellen. Som vist ovenfor for celler dyrket i kultur, farging av vev er en fordel, men ikke avgjørende, og kan øke effekten av mange funksjoner. Fig. 5 ° C og D viser en region av nedsatt cortex av en rotte., Farging (kalium ferricyanide) fremhever den samlede organisasjon og celle kontakter innen epithelia av tubuli renal. Forsiktig justering av flekker og bildebehandling forhold kan avdekke forskjellige og utfyllende informasjon som for eksempel vev arkitektur, f.eks., vev farget med uranyl acetate gi et klart bilde av den ekstracellulære matrix (data ikke vist).

Samtidig Foton Samling (CL). BSE-påvisning i våt SEM kan bli supplert ved samtidig samling av fotoner., Den scanning electron beam interesserer molekyler i prøven, som så kan sende ut lys ved karakteristiske bølgelengder (CL). Lysintensiteten deretter brukes til å utlede et bilde av fordelingen av scintillating molekyler, enten endogene til cellen eller etiketter som kan bli introdusert extraneously. Dette bildet er hentet samtidig med avbildning av BSE på en oppløsning begrenset av elektron–saken vekselsvirkningene, og ikke av lys diffraksjon (6). Vi satt en lys guide inn i væsken under prøven, som leder lyset til en photomultiplier., Dette oppsettet gir god kopling og effektiv innsamling av fotoner opphisset av electron beam uten at det går ut over effektiviteten av samtidige BSE gjenkjenning.

Fig. 6 viser ubehandlet CHO-celler, visualisert samtidig av BSE og fotoner. I Fig. 6A , cellen grenser er klart beskrevet i elektron-bildemodus, og kjernen (sammen med sine nucleoli) er fremtredende, som er den mørke ≈1-mikrometer flekker rundt kjernen. Disse vises i cytoplasma i alle eukaryote celler vi har undersøkt, og selv om antallet varierer, har de som regel er spredt rundt kjernen., I CL bildet vist i Fig. 6B , cellen skissere og kjernen er klart definert, en indikasjon på en fordeling av scintillating molekyler (tilsvarende autofluorescence) i cellen. I denne modusen, den samme stedene er preget av en høy emisjon av fotoner. Kombinasjonen av høy cathodoluminescent signal og høy karbon innhold er typisk for lipid dråper (11), som deltar i energy lagring av cellen (12)., En uavhengig test av å legge til 200 µM oljesyre forårsaket en sterk spredning av disse dråper i cellen (data ikke vist), i tråd med forestillingen om at den observerte flekker er lipid dråper.

Våt SEM har en fordel over standard SEM teknikker i bevaring av lipider, spesielt i store grupper, slik som kalles lipid dråper. Eliminerer behovet for tørking lagrer lipider fra organiske løsemidler som kan oppløse dem. Selv om osmium behandling vil bevare noen lipid bilayers, i større aggregater osmium reagerer raskt å opprette en ekstern skorpe som ikke lar osmium i, forlater grupper sårbare for påfølgende organisk løsemiddel behandling., I kryogeniske forberedelser, tendens til spalting prosess for å knekke sammen kalles lipid–vann grenser er også en fare for store lipid strukturer.

High-resolution imaging av markører er en svært attraktiv mulighet til CL-påvisning-modus, noe som krever utvikling av etiketter for bestemte molekyler i cellene. I Fig. 9, som er publisert som støtter informasjon på PNAS nettsted, viser vi at standard fluoriserende perler 0.2 µm i diameter avgir fotoner intenst under electron beam, og kan avbildes med en oppløsning på ≈100 nm (7)., Avbildning av mindre perler er begrenset av lav lysstyrke, som innebærer utvikling av spesialiserte scintillasjon perler på liten diameter . Fordi mekanismen for eksitasjon av scintillasjon er sterkest når strålen er direkte impinging på perle, vi forventer at dette kan forlenge oppløsning av fluorescerende imaging en størrelsesorden utover det som er tilgjengelig med optisk mikroskopi.