Good Mood

introductie

next-generation sequencing (NGS) is snel uitgebreid naar de klinische setting in Hemato-oncologie en oncologie, aangezien dit grote voordelen kan opleveren voor diagnose, selectie van behandeling en/of prognose voor veel patiënten (1)., Onlangs werden verschillende artikelen gepubliceerd over de validatie van diep gerichte NGS in de Klinische Oncologie (2, 3), waaronder een uitgebreide aanbeveling van de Association for Molecular Pathology en het College Of American pathologen (1). Het gebrek aan standaardisatie van gerichte NGS-methoden beperkt echter nog steeds de toepassing ervan in de klinische praktijk (4).

een uitdaging in het bijzonder is de correcte detectie van mutaties aanwezig bij lage variant allelfrequenties (VAF) en standaardisatie van sequencing dekkingsdiepte (1, 5, 6)., Dit is vooral belangrijk voor mutaties die klinische gevolgen hebben bij subklonale frequenties (1) zoals het geval van TP53 genmutaties (TP53mut) in chronische lymfatische leukemie (CLL) (7, 8). TP53 aberraties (tp53mut en / of chromosoom 17p deletie) behoren tot de sterkste prognostische en voorspellende markers die de behandelingsbeslissingen in CLL (9) leiden., Tegenwoordig beveelt het Europees onderzoeksinitiatief voor chronische lymfatische leukemie (ERIC) aan om TP53mut te detecteren met een detectielimiet van ten minste 10% VAF (10), en er is een groeiend aantal bewijzen dat is gewijd aan de klinische impact van kleine TP53 gemuteerde subklonen in CLL (7, 8).

Sanger-sequencing en deep targeted NGS zijn momenteel de meest gebruikte technieken voor tp53mut-analyse (10) en voor analyse van andere genen met klinische effecten bij lage allelfrequenties., Hoewel sanger het rangschikken een vrij toegankelijke rangschikkende benadering verstrekt, mist het de gevoeligheid nodig om subclones toe te schrijven aan zijn opsporingsgrens van 10-20% van gemuteerde allelen te ontdekken (10). NGS-gebaseerde analyse heeft zo een prominente plaats verworven in diagnostische laboratoria voor de detectie van somatische varianten en verschillende technische ontwikkelingen van foutcorrectie strategieën, zowel computationele als experimentele, worden ontwikkeld voor de nauwkeurige identificatie van laag-niveau genetische variaties (11)., Daarom wijzen we op het belang van de juiste bepaling van de sequentiediepte in diagnostische NGS om een betrouwbare en reproduceerbare detectie te verkrijgen, niet alleen van lage VAF-varianten. Tot slot hebben we een verdunningsexperiment uitgevoerd om onze theoretische berekeningen te bevestigen, en we sluiten af met het bespreken van onze ervaring met diagnostische detectie van TP53mut bij CLL-patiënten en verdere perspectieven over NGS standaardisatie in kankerdiagnostiek.,

NGS Sequentiediepte en foutenpercentage

NGS sequentiediepte beïnvloedt direct de reproduceerbaarheid van variantdetectie: hoe hoger het aantal uitgelijnde sequenties, hoe hoger de betrouwbaarheid van de basisaanroep op een bepaalde positie, ongeacht of de basisaanroep hetzelfde is als de referentiebasis of is gemuteerd (1). Met andere woorden, individuele sequencing fout leest zijn statistisch irrelevant wanneer ze worden overtroffen door juiste leest., Daarom moet de gewenste dekkingsdiepte worden bepaald op basis van de beoogde LOD, de tolerantie voor vals-positieve of vals-negatieve resultaten en het foutenpercentage van de sequencing (1, 11).

met behulp van een binomiale verdeling kan de kans op vals-positieve en vals-negatieve resultaten voor een gegeven foutenpercentage en de beoogde LOD worden berekend, en kan de drempelwaarde voor een variant die een bepaalde diepte oproept worden geschat (1)., Bijvoorbeeld, gegeven een het rangschikken foutenpercentage van 1%, een mutant allellast van 10%, en een diepte van dekking 250 leest, is de waarschijnlijkheid om 9 of minder gemuteerde leest te ontdekken, volgens de binomiale verdeling, 0,01%. Daarom is de kans op het detecteren van 10 of meer gemuteerde reads 99,99% (100-0, 01%), en de drempel voor een variant aanroepen kan worden gedefinieerd. Met andere woorden, een dekkingsdiepte van 250 met een drempel van ten minste 10 gemuteerde leest zal een 99 hebben.,99% kans dat 10% van de mutant allel belasting niet zal worden gemist door de variant calling (hoewel het kan worden gedetecteerd in een andere verhouding). Op deze manier wordt het risico op een vals negatief resultaat sterk geminimaliseerd. Aan de andere kant hangt de kans op valse positieven sterk af van het sequentiefoutpercentage (aangezien de nauwkeurigheid van alle analytische metingen afhangt van de signaal-ruisverhouding) (1, 11). In ons voorbeeld is de kans op een fout-positief resultaat 0,025%; het percentage fout-positieven is echter niet verwaarloosbaar wanneer de LOD wordt verlaagd tot de waarde dicht bij het foutenpercentage., De conventionele intrinsieke NGS-foutenpercentages variëren tussen 0,1 en 1% (Phred-kwaliteitsscore van 20-30) (1, 11), afhankelijk van het sequentieplatform, het GC-gehalte van de doelgebieden (12) en de fragmentlengte, zoals getoond in Illumina gepaarde eindsequentiebepaling (13). Daarom wordt de detectie van varianten bij VAF ‘ s <2% beïnvloed door een hoog risico op een vals-positief resultaat, ongeacht de dekkingsdiepte., Het is ook belangrijk te vermelden dat het foutenpercentage van de sequencing alleen van toepassing is op fouten die door de sequencing zelf worden veroorzaakt en geen andere fouten omvat die tijdens de DNA-verwerking en de bibliotheekvoorbereiding worden geïntroduceerd, met name tijdens amplificatiestappen, die de foutenpercentages verder verhogen (1, 11).

minimale Sequentiedekking in klinische setting

Er is momenteel geen consensus over de minimaal vereiste dekking in een klinische setting met behulp van deep targeted resequencing door NGS, en daarom moet elk laboratorium zijn eigen parameters vaststellen om aan voldoende kwaliteit te voldoen (1, 5)., Tot op heden hebben slechts enkele studies de minimale dekkingscriteria aanbevolen voor diep gerichte NGS in de Klinische Oncologie: 500 dekkingsdiepte en een LOD van 5% (2), 300-500 dekkingsdiepte zonder de LOD (3) te trotseren, 250 dekkingsdiepte en een LOD van 5% met drempelaanpassing tot 1.000 dekkingsdiepte is vereist in gevallen van heterogene varianten in monsters van lage tumorcellulariteit (1), en 100 dekkingsdiepte met ten minste 10 variantlezingen en een LOD van 10% (10)., Volgens de binominale gegevensdistributie zou een dekkingsdiepte van 250 inderdaad voldoende moeten zijn om 5% VAF te detecteren met een drempelwaarde van variantondersteunende meetwaarden ≥5 (Figuur 1). Aan de andere kant zou een NGS-analyse met een dekkingsdiepte van 100, samen met een eis van ten minste 10 varianten ter ondersteuning, zoals aanbevolen door het ERIC-consortium (10), resulteren in een vals-negatief van 45% voor monsters met een LOD van 10%., Om deze theoretische berekeningen te bevestigen, voerden we twee onafhankelijke verdunningsexperimenten uit om de prestaties van TP53 NGS-analyse te schatten om 10% VAF op een diepte van 100 reads te detecteren. Inderdaad, we detecteerden 30% van valse negatieven (5 positieve monsters van 7 true-positive monsters en 9 positieve monsters van 13 true-positive monsters) in twee onafhankelijke sequencing runs. Helaas wordt het foutnegatieve percentage vaak onderschat bij gerichte hersequencing., Uit een recent onderzoek naar de interlaboratoriumresultaten van somatische variantiedetectie met VAF ’s tussen 15 en 50% in 111 laboratoria met gemelde LOD’ s van 5-15% (6) blijkt ook dat ernstige fouten in diagnostische NGS het gevolg kunnen zijn van vals-negatieve resultaten, zelfs in monsters met een hoge mutatiebelasting (6). Van drie gelijktijdige vals-positieve resultaten werden alle varianten correct gedetecteerd, maar verkeerd gekarakteriseerd (6)., Aangezien laboratoria niet zijn gevraagd om dekkingsdiepte te rapporteren voor andere regio ‘ s dan de geïdentificeerde varianten (6), mogen we alleen aannemen dat lage dekkingsdrempels of hoge variantaanroepdrempels hebben bijgedragen aan de vals-negatieve resultaten. Deze resultaten benadrukken verder de behoefte aan gestandaardiseerde dekkingsdiepteparameters in diagnostische NGS, rekening houdend met sequentiefouten en assay-specifieke fouten.

frequentie van TP53 Subklonale mutaties in CLL gedetecteerd via diagnostische NGS

om het voorkomen van lage VAF in real-world settings te evalueren, hebben we onze cohort van CLL-patiënten onderzocht op TP53mut in ons diagnostisch laboratorium beoordeeld. De TP53mut werd beoordeeld zoals eerder gemeld (14, 15). In het kort werd TP53 (exons 2-10 inclusief 2 BP intronic overlap, 5′ en 3 ‘ UTR) geanalyseerd met 100 ng gDNA per reactie., Amplicon-gebaseerde bibliotheken werden gesequenced als gepaarde-einde op MiSeq (2×151, Illumina) met een minimum doel leesdiepte van 5.000 x. de LOD van TP53mut werd ingesteld op 1%, en de varianten in het bereik 1-3% werden bevestigd door replicatie. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten die waren ingeschreven in overeenstemming met de Helsinki Declaration, en de studie werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie.

van het diagnostische cohort van 859 CLL–patiënten (April 2016-April 2019) was 25% (215/859) positief voor TP53mut, en van deze patiënten droeg 52,6% (113/215) varianten met VAF op 10% of lager., In lijn met onze waarnemingen, rapporteerde een recente studie (8) de aanwezigheid van 63 en 84% low burden (sanger negatieve) TP53muts bij CLL patiënten op het moment van diagnose en op het moment van de behandeling, respectievelijk, en bevestigde de negatieve impact op de totale overleving van TP53muts boven 1% VAF op het moment van de behandeling (8).,

Calculator voor diagnostische NGS-instellingen voor de detectie van Subklonale mutaties

om laboratoria te helpen bij het bepalen van de minimale juiste dekkingsparameters, leveren we een eenvoudige, gebruiksvriendelijke theoretische calculator (software) op basis van de binomiale verdeling (Figuur 2), beschreven in het aanvullende bestand. Een web – (of desktop -) toepassing en stand-alone broncodes in R zijn toegankelijk op Github: https://github.com/mvasinek/olgen-coverage-limit., Gebruikend deze calculator, kunnen de correcte parameters van het rangschikken van diepte en het overeenkomstige minimumaantal variant voor een bepaald rangschikkend foutenpercentage en voorgenomen LOD gemakkelijk worden bepaald leest. Bovendien kunnen de gebruikers ook rekening houden met andere fouten door eenvoudig assay-specifieke fouten aan het rangschikkend foutenpercentage toe te voegen en deze algemene fout als input aan de calculator te gebruiken. Bijvoorbeeld, in ons geval van TP53 mutationele analyse We berekend met de totale fout van ~ 1,16%, dus zetten we onze minimale dekking diepte eisen aan 2,000 met drempel van minimum 40 leest voor 3% VAF.,

discussie

hoewel diagnostische NGS prominent aanwezig zijn in klinische settings voor de beoordeling van somatische mutaties bij kanker, beperkt onvoldoende standaardisatie van sequentieparameters de implementatie ervan in de klinische praktijk (1), voornamelijk voor varianten die aanwezig zijn bij lage allelfrequenties (4). Daarom hebben we de technische kwestie van het correct bepalen van de sequentiediepte in diagnostische NGS behandeld om betrouwbare en reproduceerbare detecties van lage VAF-varianten te verkrijgen., In het bijzonder hebben we theoretische berekeningen uitgevoerd om de optimale dekkingsdiepte te bepalen voor de gewenste detectiekans van varianten bij lage allelfrequenties, rekening houdend met het sequentiefoutenpercentage. Bovendien hebben we deze theoretische berekeningen bevestigd door verdunningsexperimenten uit te voeren. Op basis van deze waarnemingen, raden we een diepte van de dekking van 1.650 of hoger (samen met de respectieve drempel van ten minste 30 gemuteerde leest) aan om ≥3% varianten aan te roepen om een 99,9% kans op variantdetectie te bereiken, alleen met behulp van de conventionele NGS sequencing fout., Varianten in het VAF-bereik van 1-3% kunnen alleen worden aangeroepen als de verkregen sequentiegegevens van hoge kwaliteit zijn (gemiddelde Q30 > 90%) en / of als de varianten worden bevestigd door replicatie of de orthogonale methode (1, 11, 16). We bieden ook een eenvoudige, gebruiksvriendelijke theoretische calculator (software) om laboratoria te helpen bij het oplossen van de juiste sequentiediepte en het bijbehorende minimumaantal variantlezingen, rekening houdend met het sequentiefoutenpercentage. Onze eenvoudige calculator kan helpen om de valse positieve en valse negatieve resultaten in diagnostische NGS te minimaliseren.,

niettemin wordt de juiste sequentiediepte ook beïnvloed door assay-specifieke factoren (1). Fouten kunnen voorkomen in vele stadia tijdens DNA-verwerking en bibliotheekvoorbereiding. De meest voorkomende zijn versterkingsfouten geïntroduceerd tijdens de NGS bibliotheek voorbereiding (1, 12, 17). Andere gemeenschappelijke bronnen van fouten hebben te maken met bibliotheekcomplexiteit (het aantal geanalyseerde onafhankelijke DNA-moleculen), de kwaliteit van DNA, en de complexiteit van het doelgebied enz. Alle mogelijke test-specifieke fouten moeten worden aangepakt door middel van testontwerp, validatie van de methode en kwaliteitscontrole.,

momenteel worden nieuwe strategieën voor foutcorrectie ontwikkeld, zowel computationeel als experimenteel, om de hoge foutenpercentages bij diagnostische NGS te verminderen (11). Tot nu toe behoren tot de meest veelbelovende methoden voor foutcorrectie UMI( Unique Molecular Identifiers), die corrigeren voor PCR-fouten (18), en signal-to-noise-correctiebenaderingen (11). Deze vooruitgang probeert de LOD te verminderen, waardoor het rangschikken van nauwkeurigheid die nodig is voor toekomstige kansen in NGS diagnose toeneemt.,

om de standaardisatie van diagnostische NGS te verbeteren, is de schatting van de juiste dekkingsdiepte een aanbevolen uitgangspunt bij de beoordeling van drempels rond een bepaalde NGS-test. Niettemin is er nog steeds een gebrek aan gepubliceerde richtlijnen met betrekking tot de minimale technische vereisten en de rapportage ervan in NGS, met name van belang voor de detectie van klonale en subklonale mutaties in kankerdiagnostiek., Dit is hoofdzakelijk toe te schrijven aan de brede waaier van benaderingen van de bibliotheekvoorbereiding, en talrijke variabelen die een rol in elke specifieke analyse van NGS spelen, die, samen met Inter-laboratoriumvariabiliteit moeilijk zijn te standaardiseren. Daarom is de vaststelling van minimale technische vereisten en de rapportage ervan in NGS zeer wenselijk., Op basis van onze ervaring in diagnostische NGS in Hemato-oncologie, stellen we voor om ten minste de volgende technische parameters te rapporteren: LOD, totale fout van NGS-analyse (of ten minste het rangschikken van foutenpercentage), de hoeveelheid DNA-input, bron en kwaliteit van DNA, minimale dekkingsdiepte en het percentage gerichte basen die op deze minimale diepte worden gesequenced, totaal aantal doellezingen die de variantregio bestrijken en aantal reads die de variant ondersteunen. Bijzondere nadruk moet worden gelegd op NGS-standaardisatie van de met formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) monsters (19, 20).,

samen benadrukt Onze studie het belang van een correcte sequentiediepte en het minimale aantal reads dat vereist is voor betrouwbare en reproduceerbare detectie van varianten met een laag VAF in diagnostische NGS. De berekening van de juiste sequentiediepte voor een bepaald foutenpercentage met behulp van onze gebruiksvriendelijke theoretische calculator (software) kan helpen om de vals-positieve en vals-negatieve resultaten in diagnostische NGS te minimaliseren, in situaties die onder andere verband houden met subklonale mutaties., De strenge testen en gestandaardiseerde minimumvereisten voor diagnostische NGS is met name wenselijk om correcte resultaten in klinische omgevingen te garanderen.

beschikbaarheid van gegevens

De voor dit onderzoek gegenereerde datasets zijn op redelijk verzoek beschikbaar voor de corresponderende auteur.

Auteursbijdragen

AP en EK ontwierpen de studie, interpreteerden de resultaten en schreven het manuscript. AP, LS, TD en PS hebben NGS-analyse uitgevoerd. TP verzamelde de patiëntenmonsters en klinische gegevens. MV voerde Bioinformatica analyse uit en schreef de calculator code. TN voorbereid webapplicatie., Alle auteurs hebben de definitieve versie van het manuscript gelezen en goedgekeurd.

financiering

subsidie: MZ CR VES16-32339A, gedeeltelijk door MH CZ—DRO (FNOl, 00098892).

belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relatie die als een potentieel belangenconflict kon worden opgevat.

Dankbetuigingen

onze excuses aan de vele auteurs wier artikelen niet konden worden geciteerd vanwege referentiegrenzen.,

Supplementary Material