resultaten en discussie
De Arabidopsis cDNA-bibliotheek werd gescreend met behulp van de 35S-gelabelde CaM-bindende screeningsmethode zoals beschreven (24). Één van de positieve klonen toonde een identieke nucleotideopeenvolging aan AtCat3 in het gegevensbestand (genbanktoetreding nr. U43147). Om te bewijzen dat AtCat3 een CaM-bindende proteã ne codeerde, werd het volledige codagegebied van AtCat3 gesubcloneerd in de pet14b-uitdrukkingsvector. De recombinant AtCat3 werd geïnduceerd door isopropyl β-d-thiogalactoside (Iptg) (Fig., 1A) en werd gezuiverd door Cam-affiniteitschromatografie tot bijna homogeniteit. Het totale bacteriële extract werd gebruikt voor CaM-bindende analyse, en het werd getoond dat 35S-geëtiketteerde CaM aan de proteã ne AtCat3 in aanwezigheid van Ca2+ bindt (Fig. 1 bis). Na het toevoegen van EGTA werd geen CaM binding waargenomen. Bovendien bindt 35s-gelabelde CaM niet aan AtCat3 toen CaCl2 werd vervangen door andere divalente kationen zoals MgCl2 of MnCl2 (Fig. 1A), wat suggereert dat CaM binding aan AtCat3 Ca2+-afhankelijk is.
CaM binding aan AtCat3., (A) Totale bacteriële eiwitten van wild-type AtCat3 werden onderworpen aan SDS/PAGE en Coomassie kleuring of overgebracht op een nitrocellulose membraan. Het membraan werd geïncubeerd met 35S-gelabelde 50 nM NOK in een buffer die 0,4 mm EGTA, 0,2 mm CaCl2, 0,2 mM MgCl2 of 0,2 mM MnCl2 bevatte. (Links) coomassie kleuring gel toont de inductie van de AtCat3 door IPTG. (Rechts) CaM-bindende test waaruit blijkt dat CaM specifiek bindt aan AtCat3 in aanwezigheid van calcium. B)het in kaart brengen van het CAM-bindingsgebied in AtCat3., (Links) coomassie kleuring gel die de totale eiwitten van wild type of deletie mutanten van AtCat3 na iptg inductie toont. (Rechts) CaM-bindende test waaruit blijkt dat calcium/CaM bindt aan wild type en mutant 1-451, maar niet aan mutant 1-414. (C) gel mobility-shift assay met CaM binding aan het synthetische peptide (aminozuren 415-451 in AtCat3) (links) in aanwezigheid van 0,2 mm CaCl2 en (rechts) in aanwezigheid van 0,4 mM EGTA.
om het CaM-bindingsgebied in AtCat3 te identificeren, werden twee C-terminale deletiemutanten gebruikt voor 35S-CaM-bindende assays. In aanwezigheid van 0.,2 mM Ca2+, CaM bindt aan het wild type en mutant 1-451, terwijl CaM niet bindt aan mutant 1-414 (Fig. 1B), die suggereren dat het CaM-bindende gebied voor AtCat3 tot aminozuren 415-451 beperkt is. Om de binding van NOK aan AtCat3 verder te bevestigen, werd een synthetisch peptide dat aan aminozuren 415-451 van AtCat3 correspondeert, geïncubeerd met nok. De vorming van het peptide-CaM complex werd beoordeeld door niet-genaturerende PAGE. Het 36-mer-peptide kan een stabiel complex met CaM vormen in aanwezigheid van Ca2+ (Fig. 1C). In afwezigheid van peptide werd één enkele Camband waargenomen., Aangezien de peptideconcentratie steeg, verscheen een andere band met lage mobiliteit, die peptide-CaM complex vertegenwoordigen. Toen de molaire verhouding tussen peptide en CaM 1:1 was, werd slechts de peptide-CaM complexe band ontdekt, die erop wijst dat er slechts één CaM-bindende plaats in peptide is. Er werd geen peptide-CaM complex gevormd in aanwezigheid van EGTA (Fig. 1C). Deze resultaten wijzen erop dat CaM zich specifiek bindt aan AtCat3 op een calciumafhankelijke manier.
Catalase komt voor in bijna alle aërobe organismen. Bij dieren is er slechts één catalase isovorm gecodeerd door één enkel gen., Daarentegen is catalase in planten aanwezig als meerdere isovormen gecodeerd door een kleine genfamilie (6, 26). Dit geldt in ieder geval voor monocots zoals maïs en dicots zoals tabak, Arabidopsis en pompoen, waarin catalase goed wordt gekenmerkt. Interessant, elk van hen heeft drie isovormen gecodeerd door drie genen. Om te bepalen of alle katalasen de CaM-bindende gebieden hebben, werden de aminozuursequenties van 37 katalasen van bacteriën, dieren en planten vergeleken met behulp van het pileup-programma in het gcg10-pakket., De vergelijking van de aminozuurvolgorde toonde zeer hoge homologie aan in de N-terminal 384 aa (ongeveer 60% gelijkenis en 50% identiteit). In de C-terminal 108 aa, waar het CaM-bindingsgebied zich bevindt, was er echter zeer weinig overeenkomst tussen AtCat3 en andere niet-plantaardige katalases (ongeveer 21% homologie en 14% identiteit). Niettemin vertoonden alle plantenkatalases een hoge homologie in dit gedeelte (ongeveer 78% homologie en 70% identiteit), met name in het gebied dat overeenkomt met het CaM-bindingsgebied in AtCat3. Fig. 2 toont de C-terminal 108-aa sequentievergelijking van 13 representatieve katalassen., Hoewel de aminozuursequenties in de gekarakteriseerde CaM-bindende eiwitten niet behouden blijven in het CaM-bindende gebied, hebben de meeste van hen een secundaire structurele functie, de basische amfifiele α-helix (27), Zoals het auxine-gereguleerde eiwit ZmSAUR1 (24) en het plantchimerische Ca2+/CaM-eiwitkinase (28). Merk op dat er vaak negatief geladen aminozuren in CaM-bindende gebieden zijn, maar de netto last is positief (16). Gebaseerd op de spiraalvormige wielprojectie met behulp van het GCG-programma, werd vastgesteld dat de aminozuren 438-451 in AtCat3 in staat zijn om een basis amfifiele α-helix te vormen., Het is duidelijk dat de ene kant van het spiraalvormige wiel hydrofoob is en de andere kant hydrofiele is met netto positieve ladingen. Analyse van de aminozuursequenties die overeenkomen met het CaM-bindingsgebied van AtCat3 voorspelde het bestaan van een amfifiele α-helix in enkele andere plantaardige katalasen. Interessant is dat van drie catalase-isovormen in maïs, tabak, Arabidopsis en pompoen, er minstens één isovorm is met de amfifiele α-spiraalvormige structuur in elke soort, bijv.,, tobacco1 (aminozuren 431-444), maize3 (aminozuren 442-455), en pumpkin1 (aminozuren 438-451), evenals Arabidopsis AtCat1 (aminozuren 438-451). Of het waar is voor alle plantensoorten is niet duidelijk vanwege de beperkte catalase sequenties voor andere plantensoorten in GenBank. Op basis van de gegevens over de kristalstructuur van bacteriële en zoogdierkatalasen Zijn α-helices de typische structuren in het C-eindgedeelte van deze katalasen (29), maar volgens de projectie van het spiraalvormige wiel bestaat er in dit gedeelte geen basale amfifiele α-spiraalvormige structuur.,
om te testen of CaM zich bindt aan gezuiverde catalase uit planta, werd tobacco catalase gezuiverd van de bladeren op basis van Durner en Klessig (10). Een CaM-Sepharose kolom werd gebruikt als laatste stap in het zuiveringsproces. De samenvatting van de zuiveringsstappen van catalase met 1000 g tabaksbladeren is weergegeven in Tabel 1. Tabak catalase werd gezuiverd tot bijna homogeniteit zoals beoordeeld door SDS / PAGE en zilverkleuring (Fig. 3, rijstrook 1). Catalase identiteit werd bevestigd door Western blotting met een mAb tegen de tabak catalase (Fig. 3, rijstrook 3)., CaM binding aan gezuiverde tabak catalase werd aangetoond door de volgende benaderingen. – voor de zuivering van tabakskatalase werd een CaM-Sefarosekolom gebruikt. Het herstelpercentage voor deze stap was 81% (Tabel 1), wat erop wijst dat het grootste deel van de catalase uit tabaksbladeren een Cambindend eiwit is. (ii) 35s-gelabelde NOK werd gebruikt om de binding aan de gezuiverde catalase te testen in aanwezigheid van 0,2 mm CaCl2 (Fig. 3, rijstrook 5). Recombinant AtCat3 werd gebruikt als controle (Fig. 3, rijstroken 2, 4 en 6). Toevoeging van 0.,4 mM EGTA afgeschaft NOK binding, wat suggereert dat NOK bindt aan de plant catalase op een Ca2 + – afhankelijke manier. CaM-bindende analyses werden ook uitgevoerd om te bepalen of het aan schimmel, runderen, of menselijke catalase bindt. De resultaten toonden aan dat geen van deze niet-plantaardige katalasen enige CaM-binding vertoonde (gegevens niet getoond), wat in overeenstemming is met de vergelijkingen van de aminozuurvolgorde (Fig. 2).,
- View inline
- View popup
zuivering van catalase uit tabaksbladeren
CaM bindt aan plant catalase. Rijstrook 1, zilverkleuring die de zuiverheid van de catalase van tabaksbladeren toont. Rijstrook 3, Westelijke vlek die toont dat monoclonal het antilichaam van tabakskatalase gezuiverde catalase kan ontdekken. Baan 5, CaM-binding assay toont aan dat 35S-CaM bindt aan gezuiverde catalase. Twee-microgram recombinant AtCat3 werd geladen als controle in elk experiment (banen 2, 4 en 6).,
De CaM-bindingsplaats of nauw naast elkaar liggende regio ‘ s in andere gekarakteriseerde CaM-bindende eiwitten functioneren vaak als de autoinhibitory of pseudosubstrate domeinen. Dit gebied handhaaft de doelproteã nen in een inactieve staat bij afwezigheid van Ca2+ signaal, zoals in installatiechimerische Ca2+/CaM-afhankelijke eiwitkinase (30) en glutamaatdecarboxylase (31). Om de significantie van CaM-binding aan plantaardige katalasen te bestuderen, werden de katalytische activiteiten van recombinant AtCat3 en gezuiverde tabakskatalase gemeten in aanwezigheid en afwezigheid van CaCl2 en CaM., Soortgelijke experimenten werden ook uitgevoerd met andere niet-plantaardige katalases. De recombinant atcat3 met E. coli-expressie vertoonde geen activiteit. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in een ander laboratorium (Zhixiang Chen, persoonlijke communicatie). Dit kan het gevolg zijn van het ontbreken van de juiste structuur voor recombinante catalase, omdat de actieve catalase een tetrameer is dat bestaat uit vier identieke of soortgelijke subeenheden (6, 10, 26). Daarentegen vertoonde de gezuiverde tabakskatalase een significante Ca2+ / CaM-afhankelijke verandering in activiteit tijdens de zuiveringsstappen (Tabel 1)., De stimulatory gevolgen van Ca2 + / CaM zijn ongeveer 2,2 vouwen in elke stap, behalve de steekproef die na de cam-Sepharose chromatografie werd verkregen. Het toonde een hogere stimulatie van de catalase-activiteit (2,5-voudig) mogelijk als gevolg van de verwijdering van niet-Ca2+/CaM-bindende catalasefractie (Tabel 1). De niet-Ca2+/CaM-bindende catalasefractie had een specifieke activiteit van 59,6 eenheden (basale activiteit). Ca2+ / CaM stimuleerde echter de activiteit van deze fractie van catalase niet (gegevens worden niet getoond)., Deze resultaten geven aan dat Ca2+/CaM in staat is om de tabakskatalase te activeren in de fractie die werd verkregen na CaM-Sefarose chromatografie, wat overeenkomt met de CaM-bindende resultaten. Om de effecten van Ca2+/CaM op de activiteit van katalasen uit verschillende bronnen te vergelijken, werd de relatieve activiteit gebruikt, omdat er een significant verschil is in de specifieke activiteit van katalasen van verschillende soorten. Bijvoorbeeld, A. niger catalase heeft de specifieke activiteit van 5,7 eenheden; boviene lever catalase, 51,9 eenheden; menselijke erytrocyten, 39,5 eenheden; tabak catalase, 63.,1 eenheden (bij afwezigheid van Ca2+ / CaM). Fig. 4A toont aan dat CaCl2 alleen of CaM alleen geen stimulerend effect had op de catalase-activiteit van tabak (ongeveer 40% van de maximale activiteit). Er werd geen verschil in katalytische activiteit waargenomen bij schimmels, runderen of menselijke katalasen in aanwezigheid of afwezigheid van Ca2+, CaM en Ca2+/CaM (Fig. 4A). Door CaCl2 te vervangen door MgCl2, was er geen significante verandering in de activiteit van tobacco catalase in de aanwezigheid of afwezigheid van CaM (gegevens niet weergegeven)., Om het effect van Ca2+/CaM op de activiteit van plant catalase verder te documenteren, werd 10 µM van het peptide dat overeenkomt met Atcat3 CaM-bindingsgebied (415-451) toegevoegd aan elk reactiemengsel. Nietplant katalases werden niet beïnvloed door de toevoeging van het peptide. Het stimulerende effect van Ca2+ / CaM op de catalase-activiteit van tabak werd echter opgeheven door de toevoeging van het peptide (Fig. 4A). Bovendien hing het remmende effect van het peptide op de catalase-activiteit van tabak af van de concentratie van het peptide (Fig. 4B)., De catalase-activiteit werd met ongeveer 58% geremd, wat dicht bij de basale activiteit van catalase ligt. Het peptide had echter geen effect op de activiteit van boviene catalase bij alle geteste concentraties (Fig. 4A). Deze resultaten suggereren dat Ca2+/CaM een stimulerend effect heeft op de gezuiverde plant catalase, maar geen effect heeft op de nietplant katalases.
Calcium / CaM reguleert de katalytische activiteit van plant catalase. De activiteit van catalase werd gemeten door het H2O2-verval bij 240 nm te controleren voor en na toevoeging van catalase in aanwezigheid en afwezigheid van Ca2+ en/of CaM., De activiteit werd uitgedrukt als een percentage van de maximale activiteit voor elke catalase. De gegevens zijn het gemiddelde ± SE van vier afzonderlijke experimenten. (A) CaM activeert tabak catalase in aanwezigheid van calcium. Het peptide dat overeenkomt met het CaM-bindende gebied in AtCat3 (aminozuren 415-451) remt de activiteit van tabakskatalase. B) kinetiek van de remming van de catalase-activiteit van tabak door peptide (aminozuren 415-451). ● , runderlever catalase;○, tabak catalase.,
Het is bekend dat catalase een overheersend peroxisomaal enzym is, maar het komt ook voor in de mitochondriën en het cytoplasma (32). Bijvoorbeeld, mais Cat3, die een CaM-bindende catalase op basis van aminozuurvolgorde vergelijking zou kunnen zijn, is een mitochondrial proteã ne (33). Onze resultaten (vijgen. 1-4) aantonen dat CaM bindt aan plant catalase en zijn activiteit reguleert. Om de aanwezigheid van deze regulerende activiteit in vivo aan te tonen, hebben we onderzocht of CaM coëxisteert met catalase in de peroxisomen van planten., Organellen van geëtioleerde pompoen cotyledon extracten werden gescheiden door sucrose dichtheid centrifugeren. Om de contaminatie van cytosolic proteã nen te verwijderen die in de oplossing aanwezig zouden kunnen zijn of enkel geassocieerd met het peroxisomal membraan, werden de geïsoleerde peroxisomen behandeld met proteïnase K. op deze manier werden de peroxisomal proteã nen die door het peroxisomal membraan van protease werden afgeschermd niet verteerd (34, 35). De identiteit van de peroxisomale fracties werd bewezen door het meten van de catalaseactiviteit (35)., CaM is zeer behouden over koninkrijken (13-16), vandaar deden we Westerse analyse met een anti-menselijk cam antilichaam. Als controle werd de recombinant aardappelcam PCM6 gebruikt (Fig. 5, rijstrook 3). Interessant is dat een band in een grootte vergelijkbaar met PCM6 aanwezig was in de peroxisomale fracties, maar de intensiteit was aanzienlijk lager in vergelijking met cytosolic CaM (Fig. 5). Deze resultaten wijzen erop dat CaM en catalase colokalized zijn in de peroxisomen. CaM is een klein zuur eiwit dat voornamelijk tot expressie komt in het cytoplasma., In planten is echter aangetoond dat CaM aanwezig is in verschillende organellen zoals de kern en de chloroplasten (36, 37) en de extracellulaire matrix (38). Ook, bestaan de CaM-geregelde proteã nen in extracellulaire matrijs, kern, en chloroplasten (38-40). Hoe CaM het membraan kruist is niet duidelijk. Recente studies tonen aan dat posttranslationele wijzigingen een rol spelen in de translocatie van sommige CaM-isovormen. Bijvoorbeeld, wordt een petunia CaM-als proteã ne, CaM53, geassocieerd met plasmamembraan wanneer de proteã ne prenylated is. Als prenylering wordt geremd, wordt CaM53 voornamelijk in de kern aangetroffen (41).,
het bestaan van CaM in peroxisomen. Twintig microgram totale proteïnen van het peroxisoom en cytosol werd gescheiden in 15% SDS/pagina en onderworpen aan westerse analyse. CaM werd gedetecteerd door een anti-bovine cam antilichaam. Twee microgram recombinant potato CaM PCM6 werd gebruikt als controleapparaat. Rijstrook 1, peroxisoomfractie; rijstrook 2, cytosolfractie; rijstrook 3, PCM6.
voor zover wij weten is er geen rapport dat de calciumconcentratie in de peroxisomen bespreekt., Op basis van een recent aangepast model van de peroxisome biogenese, ontstaat het peroxisoom uit het endoplasmatisch reticulum (ER) door middel van preperoxisomale blaasjes (42). Het is bekend dat de ER een van de intracellulaire calciumpools is. Zo zou de calciumconcentratie in peroxisomen even hoog kunnen zijn als in de ER. Het meten van de peroxisomale calciumconcentratie en het monitoren van een verband tussen de verandering van de calciumconcentratie in cytoplasma en peroxisoom zou moeten helpen bij ons begrip van hoe peroxisomale catalase wordt gereguleerd door Ca2+/CaM., Bijvoorbeeld, kon de vrije calciumconcentratie in de transgene installaties met gereconstitueerde aequorin met een peroxisome-richtsignaal worden gemeten. Aequorine is een calciumgevoelig luminescent eiwit, waarvan de luminescentie direct de calciumverandering rapporteert (43). Omdat peroxisoom een belangrijke organel is die de toxische ROS, voornamelijk H2O2, verwijdert, is het redelijk om te speculeren dat de peroxisomale catalase-activiteit de hele tijd hoog blijft om H2O2 in situ snel te degraderen. Fluctuaties in het cytosolisch calcium kunnen echter een belangrijk effect hebben op de cytosolisch catalase-activiteit., Het is belangrijk om te benadrukken dat niet alle catalasen CaM-bindende eiwitten zijn. Vandaar, zijn verder onderzoek nodig om de Betekenis van Ca2+/CaM in het controleren van de activiteit van catalase in verschillende organellen aan te pakken.
biotische en abiotische spanningen veroorzaken een Ca2 + – instroom en de verhoogde cytosolische Ca2 + stimuleert de productie van H2O2, dat als boodschapper in de omringende cellen verspreidt en de fysiologische respons induceert (19, 20). Onze resultaten suggereren dat verhoogde cytosolic Ca2+ H2O2 niveaus kan verminderen door middel van Ca2+ / CaM-gemedieerde stimulatie van catalase activiteit (Fig. 4)., Wij stellen voor dat verhoogde cytosolic Ca2 + dubbele rollen in het regelen van H2O2 homeostase heeft (Fig. 6): (I) positieve Regulatie genereert H2O2 door direct NADPH oxidase te activeren, dat affiniteit heeft voor Ca2+ (22) en indirect meer NADPH te produceren door middel van Ca2+/CaM-gereguleerd NAD kinase (23); en (ii) negatieve Regulatie vermindert H2O2 door de catalase-activiteit te stimuleren door Ca2+/CaM-modulatie (Fig. 4)., Signaalgeïnduceerde veranderingen in Ca2 + transiënten kunnen verschillen in de frequentie, duur, amplitude en ruimtelijke lokalisatie van oscillaties, en wijze van ruimtelijke propagatie, wat leidt tot differentiële effecten op de calciumdoelproteã nen (12, 44).
Model met door Ca2+veroorzaakte veranderingen die leiden tot de positieve en negatieve regulering van het H2O2-niveau in installaties. Voor positieve regelgeving, leiden de extracellulaire signalen een toestroom van Ca2+, die de generatie van H2O2 verhoogt., Dit kan voorkomen door NADPH-oxidase te activeren, die affiniteit aan Ca2+ heeft, en de productie van NADPH door middel van CaM-geregeld nad-kinase te verhogen. Voor negatieve regelgeving bindt Ca2 + aan CaM, en het Ca2 + /CaM-complex stimuleert de katalytische activiteit van catalase, wat leidt tot de snelle afbraak van H2O2. De toename van H2O2 kan de Ca2+ instroom stimuleren door het activeren van het calciumkanaal.
